Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究

1、Doxycyciine抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究作者：张强波 李杰 时昌文 李捷 孙京杰 曹莉莉【摘要】目的：观察多西环素(Doxycycline)对人肝细胞性肝癌细胞系 HepG2生长抑制和凋亡的作用，并初步探讨其作用机制。方法：不同浓度的Doxycyciine(5、10、20、30和50 mg/L)对体外培养人肝癌细胞系 HepG2进行不同的时间 干预(24、48和72 h), MTT法测定细胞生长抑制率，TUNEI法检测细胞凋亡率， 免疫细胞化学检测Fas、FasL及MMP-2蛋白表达的变化。结果：Doxycycline作 用HepG2细胞48 h和72 h后，细胞生长被明

2、显抑制，与无药对照组比较差异有 统计学意义(P)。结论：Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2具有明显的生长抑 制和促凋亡作用，其机制可能与下调MMP-2上调FasL从而启动Fas/FasL膜受体途径有关。【关键词】肝肿瘤-Doxycycline 细胞凋亡-FasL MM-2【ABSTRACTObjective: To observe the effect and mecha nismof doxycycli ne on cell growth in hibiti on and the apop tosis of huma nhep atoma cell HepG2 in vitro.

3、 Methods: HepG2 cells were treated with doxycycli ne at differe nt concen trati ons and time in vitro. Cell growth in hibiti on rate was detected by MTT assay, and apop tosis rate was identifiedby TUNELassay, the expression of Fas, FasL and MMP-Qroteinswere exam ined by immuno cytochemical stai ning

4、. Results: Treated with doxycycline at differentconcentrations(5，10, 20, 30 and 50 mg-L-1 )for 48 and 72 hours, the growth of HepG2 cells decreased sig nifica ntly(P) . Conclusion: Doxycycline might inhibit cell growth and induceapop tosis of HepG2 sig nifica ntly. The mecha nism of doxycycli ne in

5、duced apop tosis might be associ多西环素(Doxycycline )为四环素类抗生素的一种，已有研究表 明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用1-3:,而其对人肝癌细胞的生长抑制作用国内外未见报道。本研究观察了Doxycycli ne对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。1材料与方法实验材料人肝细胞性肝癌细胞系HepG2购自美国典型物保藏中心 细胞库，用含10%台牛血清的RPMI1640培养基，37C、5%CO饱和湿度的孵箱内 常规培养，每日倒置显微镜观察细胞生长情况，3d换液，适时夷酶消化传代。 四甲基偶氮

6、唑盐（MTT、DMS和Doxycyciine 均购自Sigma公司，TUNEl凋亡检 测试剂盒购自Roche公司，FasL兔多克隆抗体及MMP-S单克隆抗体购自 SANTCRU公司，Fas鼠单克隆抗体购自北京中山公司。方法MTT法检测肿瘤细胞生长能力取对数生长期HepG2田胞，配成X 105mL-1的单细胞悬液，96孔培养板每孔加入200卩L细胞悬液约3X 104细胞，细 胞常规培养4 h,贴壁后每孔重新加入含不同浓度 Doxycycline的培养液2卩L， 使其终质量浓度约分别为5、10、20、30和50 mg/L,每个药物浓度设5个孔。 同时设无药对照组5孔，无细胞培养液1孑U调零孔）。3

7、7C、5%CO饱和湿度 的孵箱内常规培养24、48和72 h,分别取培养板MTT法计算药物作用后的吸光 度（optical density,OD ）。按以下公式计算细胞生长抑制率：TUNE检测细胞凋亡取对数生长期生长良好的HepG2细胞，将其分 别接种于200 mL培养瓶中，细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为5mg/L和20mg/L Doxycycline的条件培养液作用24、48和72 h。胰酶消化各组细胞后，取 1滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁生长 4 h制成细胞爬片，用1 ：1甲 醇丙酮固定30 min,保存备用。按TUNE试剂说明书（Roche）操作，采用倒置 荧光显微镜成像，随

8、机选取5个视野300个细胞计算细胞凋亡率。细胞免疫组织化学法检测FasL、Fas及MMP-2蛋白的表达 应用前述 方法制作细胞爬片，分别加入 FasL、Fas及MMP-2-抗，用SABC法进行细胞免 疫组织化学染色，DAB显色。判断标准 FasL、Fas及MMP-2蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质， 阳性反应为细胞膜和（或）细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果判定参照 文献4,以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量分析。随机观察5个高倍视野，根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为04分：无阳性细胞为0分，75%为4分；染色的深度以多数细胞的显色反应为准，着色强度计04分：无色为0分，淡黄色为1分

9、，深黄色为2分，棕黄色为3分，棕褐色为4分。将上 述两项指标的评分相加。每张片分别由2个观察者进行盲法测定，最后取两观察 者所得平均值。统计学处理使用统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析 或独立样本t检验，P），48h和72 h组较对照组均出现了不同程度的生长抑制 作用（F=F=; P、，而在作用48、72 h后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加， P（图 5）。3 讨论Doxycycline是一种化学修饰的四环素类抗生素，近年来，有关其对肿瘤生长抑制作用的研究报道已被广泛关注。Cakir等5发现5、10 mg/LDoxycycline对狗骨肉瘤细胞的生长抑制率分别为 50% 72%

10、Bettany等6 研究发现Doxycycline可以诱导兔破骨细胞的凋亡。本实验结果显示，550 mg/L 浓度Doxycycline对HepG2细胞具有显著的生长抑制作用，并且呈现明显的剂量 和时间依赖性。Doxycycline可促进HepG2细胞凋亡，随着药物浓度及作用时间 的增加，细胞凋亡率亦相应升高，提示Doxycycline对人肝细胞肝癌细胞系HepG2 具有明显的促凋亡作用，进而可抑制肿瘤细胞的生长。细胞凋亡是一个比较复杂的过程，可通过多条启动途径实现，其中膜 受体途径（Fas/FasL）是最重要的途径之一。Liu J等7发现Doxycycline 可通过Fas/FasL介导的膜

11、受体途径诱导T淋巴细胞凋亡，最近研究报道 Doxycycline能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖，并证实其主要通过Caspase依赖 的细胞凋亡发挥作用3o有报道表明人肝癌细胞系HepG2表面 Fas有较强的表 达8。本研究结果显示 20 mg/LDoxycycline 作用HepG2细胞48 h后FasL蛋 白表达明显增加，与对照组比较差异有统计学意义 （P）。提示Doxycycline可能 通过上调细胞表面FasL的表达而启动Fas/FasL介导的信号传导途径诱导细胞凋 亡。有报道Doxycyciine作为MMP卬制剂，具有抑制胶原酶和其他MMP 的作用1,5,9 。体内外实验发现，Doxyc

12、yciine对前列腺癌、乳腺癌及骨肉瘤 均有明显的抑制作用，并证实它可抑制MMPS勺表达及活性，从而抑制肿瘤的生长1-2,9 。MMP可通过多种途径调控肿瘤生长，亦可通过降解基底膜及启动 血管内皮细胞生长来促进肿瘤增长及转移10，还可通过降解FasL以减少肿瘤细胞的凋亡11 0本研究结果显示，20 mg/L Doxycycline 作用HepG2细胞48 h 后，实验组MMP-2表达阳性率与对照组比较明显降低（Pv）o推测Doxycycline 抑制体外HepG2细胞生长作用可能通过降低 MMP-2表达，从而减少FasL的降解， 增加其表达，进而启动Fas/FasL膜受体途径来促进细胞的凋亡。

13、药物对肿瘤的抑制作用机制往往是多方面、多途径的，同样 Doxycycline通过何种途径影响细胞FasL及MMP-2表达，其具体机制尚不完全 清楚，有待做更进一步的实验研究和机制探讨。但初期的体外研究得到了较理想实验结果，有望为肝癌的临床诊治寻求一种新的药物治疗。【参考文献】Fife RS, Sledge GWJr. Effects of doxycycline on cancer cells in vitro and in vivoJ. Adv Dent Res, 1998, 12（2） :94-96.Fife RS, Sledge GW Jr, Roth BJ, et al. Effect

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15、XX 30( 4)： 318。osteosaraIn Vivo,Cakir Y, HahnKA Direct action by doxycycline against canine cell proliferationand colloagenase (MMP-【activity in vitroJ.1999,13( 4): 327 331.apop tosisBettany JT, Peet NM,WolowaczRG et a1. Tetracyclines induce in osteocoastsJ. Bone, 20XX, 27(1): 75 80.Liu J, Kusz yn s

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