环境工程微生物学

1、环境工程微生物学主要内容 微生物类群与形态结构（认识微生物） 微生物的营养与生长（懂得如何培育） 微生物的代谢（了解营养物质如何转化） 微生物的遗传与变异（掌握如何培育新菌种） 微生物的生态（了解微生物与环境的关系） 微生物对污染物的降解和转化（应用的理论基础、生物化学反应） 生物技术在环境污染治理工程中的应用（工程实际,看视频）第一章 绪论（Introduction）本章要点：（1）微生物与人类的关系（2）微生物的发现和微生物学的发展历史（3）微生物的特点（4）环境工程微生物学涉及的技术系统和发展方向目标：了解微生物的基础知识和该学科的历史及发展方向第一节 微生物与人类的关系微生物无处不在，

2、我们无时不生活在“微生物的海洋”中细菌数亿/g土壤，土壤中的细菌总重量估计为：10034 10 12 吨；每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万；t 体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证； 帮助消化、提供必需的营养物质、组成生理屏障人体体表及体内存在大量的微生物。t 微生物可以为我们提供很多有用的物质； 有机酸、酶、各种药物、疫苗、奶酪、啤酒、酱油等基因工程为代表的现代生物技术；第二节微生物的发现和微生物学的发展历史（一）微生物的发现我国8000年前就开始出现了酿酒；4000年前埃及人已学会烘制面包和酿制果酒；2500年前发明酿酱、醋，用曲治消化道疾病；公元六世

3、纪(北魏时期)贾思勰的巨著“齐民要术”；公元前112年-212年间，华佗：“割腐肉以防传染”；公元九世纪痘浆法、痘衣法预防天花；16世纪，古罗巴医生G.Fracastoro：疾病是由肉眼看不见的生物(living creatures)引起的；1664年，英国人虎克（Robert Hooke）曾用原始的显微镜对生长在皮革表面及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察。1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antonyvan leeuwenhoek）首次观察到了细菌。他没有上过大学，是一个只会荷兰语的小商人，但却在1680年被选为英国皇家学会的会员。（二）微生物学的奠基人1. 巴斯德 (1) 发现并证实发酵是

4、由微生物引起的；化学家出生的巴斯德涉足微生物学是为了治疗“酒病”和“蚕病”(2) 彻底否定了“自然发生”学说；著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物，是它们引起有机质的腐败。(3) 免疫学预防接种首次制成狂犬疫苗(4)其他贡献巴斯德消毒法：6065作短时间加热处理，杀死有害微生物2. 柯赫1）微生物学基本操作技术方面的贡献a）细菌纯培养方法的建立土豆切面 营养明胶 营养琼脂（平皿）b）设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养c）流动蒸汽灭菌d）染色观察和显微摄影（2）对病原细菌的研究作出了突出的贡献a）具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌b）发现了肺结核病的病原菌；（1

5、905年获诺贝尔奖）c）证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则 著名的柯赫原则1、 在每一相同病例中都出现这种微生物；2 、要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会 重复发生；4 、从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。（三）微生物学发展过程中的重大事件t 1890 Von Behring 制备抗毒素治疗白喉和破伤风；t 1892 Ivanovsky 提供烟草花叶病毒是由病毒引起的证据；t 1928 Griffith 发现细菌转化；t 1929 Fleming 发现青霉素；t 1944 Avery 等证实转化过程

6、中DNA是遗传信息的载体；t 1953 Watson和Crick 提出DNA双螺旋结构；t 19701972 Arber、Smith和Nathans发现并提纯了DNA限 制性内切酶；t 19831984 Mullis 建立PCR技术。第三节 微生物的特点（1）个体小:测量单位：微米或纳米杆菌的平均长度：2 微米； 1500个杆菌首尾相连= 一粒芝麻的长度； 10-100亿个细菌加起来重量 = 1毫克； 面积/体积比：人 = 1，大肠杆菌 = 30万。（2）结构简单：无细胞结构（病毒）；单细胞；简单多细胞3）胃口大：消耗自身重量2000倍食物的时间：大肠杆菌：1小时 人：500年（按400斤/年

7、计算）（4）食谱广：微生物获取营养的方式多种多样，其食谱之广是动植物完全无法相比的！纤维素、木质素、几丁质、角蛋白、石油、甲醇、甲烷、天然气、塑料、酚类、氰化物、各种有机物均可被微生物作为粮食。（5）繁殖快：大肠杆菌一个细胞重约10 12 克，平均20分钟繁殖一代。24小时后： 4722366500万亿个后代，重量达到：4722吨。48小时后：2.2 10 43个后代，重量达到2.2 10 25 吨。相当于4000个地球的重量！ 一头500 kg的食用公牛，24小时生产 0.5 kg蛋白质，而同样重 量的酵母菌，以质量较次的糖液（如糖蜜）和氨水为原料，24小时 可以生产 50000 kg优质蛋

8、白质。（6）变异易： 个体小、结构简、且多与外界环境直接接触繁殖快、 数量多。 突变率：10-5 10-10, 短时间内产生大量的变异后代。第四节 环境工程微生物学涉及的技术系统和发展方向l 菌株筛选、驯化、鉴定、结构、生理生化、遗传变异、污染物降解、转化途径l 基因工程、发酵工程、细胞工程、酶工程l 微生物监测l 污染治理工程中的检测与自动控制l 微生物应用过程的设计与施工l 利用微生物作用实现清洁生产发展方向：分离鉴定出降解特定污染物的基因，并应用该基因合成高效降解污染物的工程菌的生物工程。第二章 微生物分类、形态结构及培养本章要点：1.微生物的分类鉴定与命名方法2.原核微生物（细菌、放线

9、菌）的大小、结构、形态、繁殖、培养、测试3.真核微生物（原生、后生动物、藻类）的大小、形状、营养、繁殖、鉴定4.显微镜下微生物观测样品的制备和测试方法目标：掌握污染治理中微生物的鉴定和生态习性，认识和开发新的微生物菌种。第一节 微生物的分类(Microbial Taxonomy)一、微生物的分类单位与命名 微生物：个体微小（ C + 能源 N源 P、S K、Mg 生长因子，含量：(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6)l （3）理化条件要适宜。pH值、渗透压、氧化还原电位、温度、活度l （4）经济节约。价格低廉、来源广、注意纯度l （5）高温高压灭菌。

10、在1.05Kg/cm2，121.31530min就可达到灭菌目的。（看书p53表310） 二、培养基(Culture Medium)的类型(1)按组分来源分:a.天然(天然有机物、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、玉米粉）；b.组合（高纯化学试剂 ，定量要求较高的实验研究 ）；c.半组合天然纯化学试剂（2）按物理状态分：a.液体（无凝固剂、如琼脂、明胶、硅胶，用于工业废水菌种的培养与驯化以及大多数酵母菌的培养）b.固体（加入1.5-3.0%琼脂或明胶、硅胶、马铃薯、胡罗卜条）固体培养基一般放置于平皿或试管中，微生物在其表面生长，形成菌落。固体培养基用途：菌种的分离、鉴定，菌落计数、检验杂菌、选种、育

11、种等等。 c.半固体（加入0.5%左右琼脂）用途，如微生物的运动特征观察、分类鉴定、噬菌体效价测定(双层平板法)、微生物趋倾性的研究、各种厌氧菌的培养及菌种保藏等等 培养基分类（按用途分）l a.基础（牛肉膏、蛋白胨，一般微生物均可）l b.加富（培养基中加入额外营养物，增殖某种微生物，淘汰其它，解酚菌）l c.鉴别（加入指示剂，微生物显色，快速分类鉴定，大肠杆菌伊红美蓝乳糖培养基EMB深紫色）l d.选择（“投其所好”，加入某种营养物质；“投其所抗”，加化学物质，如染料、金属盐，抑制不需要菌种l 上述四种培养基有各种配方，详见资料和实验指导书（书表412）。l 研究中常用，掌握。三、培养基的

12、配制方法l (1)生态模拟法 目标微生物生长的自然环境/具备营养和其他条件；模拟或直接取用天然基质来培养。如用肉汤、鱼汁培养多种细菌；用肥土培养放线菌等等。l (2)依据文献设计法 查阅、分析和利用相关的直接或间接的参考信息。l (3)试验比较法 试验的规模一般都要遵循由定性到定量、由小而大的原则。如可先在培养皿上作生长谱试验(auxanographic method )培养基配制的操作步骤l (1)称各营养物质l (2)一定量的水中按顺序加入培养基成分,溶解完全加入第二种,为防止沉淀加EDTA或NTA(氮川三乙酸)l (3)用10%NaOH或HCl调pHl (4)培养过程中可能产酸、二氧化碳

13、或氨气，加入缓冲剂K2HPO4、Na2CO3、NaOH调pHl (5)高压蒸汽灭菌四、常用的微生物培养基 l 细菌：用牛肉膏蛋白胨培养基(简称普通肉汤培养基)培养；l 放线菌：用高氏I号合成培养基培养；l 酵母菌：用麦芽汁培养基培养；l 牛肉膏、蛋白胨是最常用的基础培养基；l 变形虫：蛋白胨肉汤培养；l 原生、后生动物：C、N、P；常见的培养基l a、酵母富集培养基：葡萄糖5%，尿素0.1%，(NH4)2SO4 0.1%，KH2PO4 0.25%，NaHPO4 0.05%，MgSO4.7H2O 0.1%，FeSO4.7H2O 0.01%，酵母膏0.05%，孟加拉红1/3万，pH=4.5l b、

14、Ashby无氮培养基(富集自生固氮菌用)：甘露醇1%，KH2PO4 0.02%，MgSO4.7H2O 0.02%，NaCl 0.02%，CaSO4.2H2O 0.01%，CaCO3 0.5%l c、Martin培养基(富集土壤真菌用)：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%， KH2PO4 0.1%，MgSO4.7H2O 0.05%，琼脂2%，孟加拉红1/3万，链霉素30g/ml，金霉素2g/mll d、含糖酵母膏培养基(在厌氧条件下富集乳酸菌用)： 葡萄糖2%，酵母膏1% 第6节课思考题l 1.微生物个体组成中有机物占多大比例？其中干物资占多少？l 2.微生物的营养物质都有哪几类?其中哪种含量最多？l

15、3.蓝细菌、原生动物、红螺菌、甲烷菌、硝化细菌分别属于哪种营养类型？l 4.什么叫培养基？配制培养基时首选的无机盐是什么？培养基的配制原则是什么？l 5.选择性培养基和鉴别培养基有何异同？l 6.培养基使用过程中如何保持其pH值不变？l 7.培养基的物理状态是如何控制的？l 8.实际应用时，如何获得特定微生物的最佳培养基？第四节 营养物质如何通过细胞膜进入微生物细胞 l 细胞表面进行物质交换，渗透营养型。一、影响进入细胞的因素l 1.营养物质本身的性质；包括相对分子质量、溶解性、电负性、极性l 2.微生物所处的环境条件；温度(营养物质的溶解度、细胞膜的流动性及运输系统的活性)、pH和离子强度（

16、营养物质的电离程度）、结构类似物l 3.微生物细胞的透过屏障(permeability barrier)；细胞表面的细胞壁、原生质膜、荚膜和粘液层组成 透过屏障的作用 细胞壁：只对大颗粒的物体起阻挡作用，许多大分 子物质可以自由进出细胞壁； 荚膜与粘液层：结构较为疏松，对吸收营养物质影响较小； 原生质膜：影响最大，它对物质的运输具有“控制性”和“选择性” 营养物质基于上述三种因素条件下如何进入细胞内部？ 四种运输方式：简单扩散、促进扩散（不需能量、被动进行）；主动运输、膜泡运输（消耗能量，主动进行 ） 二、简单扩散、促进扩散l 被动扩散：营养物质顺浓度梯度，以扩散方式进入细胞的过程。l 特点：

17、1）微生物的细胞膜不是半透膜，是差异膜，影响物质进出细胞的速度；2）微生物中的部分细胞具有将营养物质转移功能或及时在酶系统作用下转化功能，避免积累，保持内外的物质浓度梯度，保证了物质运输的不断进行。l 被动扩散分类：包括简单扩散（不需要载体）和促进扩散（需要载体）。简单扩散的特点l （1）非特异性扩散，不是细胞吸收营养的主要方式l （2）纯粹的物理学过程，过程不消耗能量l （3）扩散的动力来自物质在膜内外的浓度差l （4）营养物质不能逆浓度运输l （5）扩散的速率与膜内外营养物质浓度差成正比l （6）营养物质在扩散过程中，既不与膜上的各类分子发生反应，自身分子结构也不发生变化l （7）相对分子

18、质量小，脂溶性强、极性弱的物质易通过简单扩散进入细胞（脂肪酸、甘油） 。促进扩散l 特点：有载体蛋白质参与l 载体蛋白渡船 透过（诱导）酶 l 发生促进扩散的物质：氨基酸、单糖、维生素及无机盐氨基酸、单糖、维生素及无机盐 l 发生促进扩散的微生物：真核微生物（用于运输糖份），原核微生物少见。三、主动运输(active transport) l 主动运输：将营养物质在能量、透过酶作用下逆自身浓度梯度由稀处向浓处移动，并在细胞内富集的过程l 能量来源：好氧与兼性厌氧微生物（呼吸能）、厌氧微生物（化学能ATP)、光合微生物（光能）、嗜盐细菌（光能）l 特点：1）在物质运输过程中需要消耗能量，而且可以

19、进行逆浓度运输；2）载体蛋白构象变化需要消耗能量，而且它还能改变反应的平衡点l 分类：简单主动运输和基团移位两种 简单主动运输simple active transportl 概念：指在消耗代谢能的同时实现溶质(营养物质)在细胞内浓集的过程，且溶质在运输前后并不发生化学变化。是大部分微生物的主要运输方式。大肠杆菌对乳糖的吸收l 载体蛋白的协同运输模式 ：单纯地将溶质从膜一侧运输到另一侧（单向载体蛋白 ） 、同向、逆向；基团位移(Group translocation) l 概念：若营养物质在膜内受到了共价修饰，以被修饰的形式进入细胞质的输送机制。通过磷酸基团发生位移，即从磷酸烯醇式丙酮酸(PE

20、P)转移到被输送的基质分子上而实现的。l 运送步骤：l 热稳载体蛋白HPr的激活：PEP+HPr 丙酮酸P-HPr（酶1）；l 糖被磷酸化后运入膜内。糖P-HPr 糖-P+ HPr（酶2）l 四、膜泡运输(memberane vesicle transport) l 是原生动物特别是变形虫(amoeba)的营养运输方式。l 变形虫 靠近营养物质 吸附到膜表面 细胞膜开始内陷 包围营养物质 膜泡 膜泡离开细胞膜进入细胞质 l 营养物质为固体为胞吞作用(phagocytosis) ；营养物质是液体为胞饮作用(pinocytosis) 第五节 微生物的培养与分离l 发展历史：l 从少量培养发展到大规

21、模培养； l 从浅层培养发展到深层或厚层培养； l 从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；l 从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；l 从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；l 从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；l 从单纯利用微生物细胞到利用高等动、植物细胞；l 从单菌发酵发展到混菌发酵；l 从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程菌”等。 在实验室或生产实践上，采取何种方法保证微生物大量繁殖。一、培养方法分类l 实验室、生产实践中均有两种方法：l （1）固体培养(Solid-state culture) l （2）液体培养(Liquid-state cult

22、ure) ，分别培养好氧菌、厌氧菌及兼性菌二、实验室培养（一）固体培养1.好氧菌的培养l 试管斜面、培养皿平板、大型的克氏扁瓶、茄子瓶等平板培养l 用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。好氧菌固体培养(Solid-state culture)平板划线培养方法l 对于好氧和兼性好氧微生物的培养主要采用斜面接种、穿刺接种和平板划线培养 l (a) 平板划线的过程：1.用接种针蘸取菌样；2.在平板固体培养基表面划线(b)培养结果：在划线的末端，逐渐出现单菌落（为什么？）2.厌氧菌的培养l （1）高层琼脂柱还原剂固体培养基或半固体培养基，加入试管中培养，下层有利于厌氧菌的生长l （2）厌氧培养皿

23、l Brewer皿：皿盖与琼脂平板的狭窄空间内置入还原剂除氧气l Bray、Spray皿：l 两皿底分别放置焦性没食子酸和NaOH吸氧反应除氧气。l （3）厌氧罐（anaerobic jar）技术l （4）厌氧手套箱（anaerobic glove box）l （5）Hungate滚管技术 l 1950年美国微生物学家发明，划时代，除氧铜柱制备高纯氮，氮驱除氧气(二）实验室液体培养1.好氧菌l 20度常压下，O在水中的溶解度为6.2ml/l，解决如何充氧的问题。l （1）试管液体培养：该法通气效果不好，适于兼性厌氧菌、微生物的生理生化试验l （2）三角瓶浅层培养适用于兼性好氧菌 l （3）台式

24、反应器：有充气、自控装置l （4）摇床培养：用812层纱布包住三角瓶口，震荡加速充氧。（广泛采用）2.厌氧菌l 凡士林-石蜡密封，加还原剂（巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉等)或无机还原剂(铁丝等，氧化还原电位达到-150mV-420mV 第7节课思考题1.影响营养物质进入细胞的因素有哪些？从细胞结构分析，哪个组分控制其选择性？2.营养物质进入细胞有哪四种方式？哪些需要能量？哪些需要载体参与？3.实验室条件下固体培养和液体培养好氧菌有哪些方法？固体培养的目的是什么？三、工程实际中微生物的培养（一）固体培养基上1好氧菌l “曲”法培养，接种过的培养基置入容器表面，薄厚度（利于通氧）l 瓶曲、袋

25、曲、盘曲、转鼓曲、通风曲（机械通风、酱油）2厌氧菌l 不多见，白酒生产（酵母菌深层地窖堆积式发酵）属于兼厌（二）液体培养基上1好氧菌l （1）浅盘培养：充氧差、效率低、推广难l （2）发酵罐（Fermenter)l 带有搅拌装置、充气、进出水口2.厌氧菌：发酵罐、UASB3.实际工程（污水处理）调试l (1)连续进水、菌种、污泥、培养基l （2）间断进水、时间、换水l （3）监测、生物显微镜（数量、种类、活性）四、微生物的分离l 1.菌落纯（菌种纯）：l 用固体培养基分离，主要有四种方法：稀释倒平板法；涂布平板法；平板划线分离法；稀释摇管法。l 用液体培养基分离，通常是采用稀释法。Koch建立的平板分离微生物技术一直是各种菌种分离的最常用手段。l .细胞纯(菌珠纯)：l （1）用“分离小室”进行单细胞分离l （2）显微操纵器l （3）菌丝尖端切割法稀释倒平板法(pour plate method)l （1）先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释(如10倍、100倍、10