大孔吸咐树脂纯化喜树碱工艺研究

1、吉首大学毕业论文吉首大学2011届学士毕业论文 论文题目 大孔吸咐树脂纯化喜树碱工艺研究作者姓名 杨 通 学号 20074192017 学 院 生物资源与环境科学学院 专业年级 2007级植物科学与技术 指导教师 赵东亮 职称 副 教 授 目 录摘 要1关键词1Abstracts1Keywords11前言12材料、仪器与试剂22.1 材料22.2仪器22.3试剂23实验部分33.1马比木喜树碱的提取33.2大孔树脂预处理33.3静态吸咐33.3.1上样液浓度的选择33.3.2洗脱剂的选择33.3.3洗脱剂浓度的选择43.3.4不同pH值对树脂吸附率的影响43.3.5 温度对树脂吸附率的影响43

2、.4动态吸附实验43.4.1上样流速对树脂吸附的影响43.4.2树脂吸附量的测定43.4.3脱流速的确定44. 结论与讨论44.1上样液浓度的选择54.2洗脱剂的选择54.3洗脱剂浓度选择54.4不同pH值对树脂吸附率的影响64.5温度对树脂吸附率的影响74.6上样流速对树脂吸附的影响74.7 树脂吸附量的测定84.8洗脱流速的确定84结论9参考文献9致谢11大孔吸咐树脂纯化喜树碱工艺研究杨 通指导老师：赵东亮 ( 吉首大学生物资源与环境科学学院 湖南吉首 416000)摘 要：本文采用乙醇溶液常温浸提的方法从马比木中提取喜树碱粗品；并用AB-8大孔吸咐树脂纯化，通过对喜树碱的上样液浓度、上样

3、PH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度、上样液流速及洗脱剂流速的研究。结果表明吸附和洗脱的最佳工艺参数为：样液质量浓度0.600mg/mL，吸附流速25BV/h；以70乙醇为洗脱剂，洗脱液流速20BV/h。关键词:马比木；喜树碱；大孔吸附树脂；吸咐；洗脱Macroporous Resin Adsorption for purification of Camptothecin Yang TongSupervisor :Zhao Dong-liang(College of Biology and Environmental Sciences , Jishou University, Jishou Hu

4、nan, 416000)Abstracts: Camptothecine crude products were gained from PittosporumliNothapodytes with ethanol solution in normal temperature. AB-8 macroporous resin was chosen for purification. Through the research of sample solution concentration, sample pH ,sample temperature , elution concentration

5、 and flow rate for adsorption and desorption, the optimal adsorption and desorption conditions of Pittosporumli Nothapodytes Camptothecine onto AB-8 resin were determined as follows: concentration of sample solution 0.600mg/ml, flow rate for adsorption 25BV/h, and the optimal ethanol concentration a

6、nd flow rate for the desorption of Pittosporumli Nothapodytes Camptothecine were 70% and 20BV/h.Keywords: Pittosporumli Nothapodytes; Camptothecine; macroporous; adsorption; elution1前言 马比木N othapodytes pittosporoides (Oliv. ) Sleum. ,为茶茱萸科假柴龙属植物,灌木或小乔木,分布于贵州、湖南、湖北、四川等地1 。喜树碱( camp tothecin, CPT)是我国特

7、有树种喜树(Camptotheca acum inata Decne. )中所含有的喹啉类衍生物生物碱,具有显著的抗癌活性,目前已有4种以喜树碱为前体合成的喜树碱衍生物获得美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床治疗结肠癌、直肠癌和复发性卵巢癌2 - 3。1966年Wa11等首次从喜树植物中分离出喜树碱之后，人们对喜树碱的生物和化学性质进行了大量的研究，主要是针对抗肿瘤研究领域。目前对其抗癌作用机理的研究已经取得了一定的进展。喜树碱的抗癌作用，起初的认为是喜树碱通过抑制核酸合成，导致癌细胞内DNA降解，近年来研究结果否定了这一观点，研究发现喜树碱主要是通过抑制癌细胞DNA复制酶，阻碍癌细胞的

8、增殖。1988年又进一步发现喜树碱主要是通过阻断DNA拓扑异构酶I合成，发挥细胞毒性的独特抗癌机理4。但受喜树碱的自身毒性及其化学特性的影响，其临床应用受到一定限制。目前，人们主要是以喜树碱为母体进行化学修饰，来获得具有抗癌活性的衍生物。在美国，喜树碱一11和TPT已经批准用于实体瘤的临床治疗。喜树碱已经成为继紫杉醇之后第二个由植物衍生的重要抗癌药物。近年来，喜树碱在农药领域的应用研究也在逐步深入。有研究发现喜树碱能造成家蝇和马尾松毛虫不育，而且对甘蔗黄螟亦有毒杀作用5。喜树碱自Wall等首次从喜树植物中分离出以来,国内外有关喜树碱提取分离和含量测定的研究已有许多报道6 -13 ,喜树碱的生产

9、也一直是以喜树的种子为原料。然而近年来,许多喜树碱生产厂家却改用马比木的根提取制备喜树碱。本文以马比木根为原料,乙醇为提取剂，提取喜树碱粗提物; 采用AB-8吸附树脂纯化,探究上样液浓度、上样PH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度、上样液流速、洗脱剂流速对纯化效果的影响，确定喜树脂纯化最佳工艺。2材料、仪器与试剂2.1 材料 干燥马比木，AB-8大孔树脂（安微三星树脂科技有限公司），PH试纸，滤纸。2.2仪器UV-160A 紫外可见分光光度计(日本，岛津)，EB-340HW电子天平(日本，岛津)，DP-32 真空干燥箱(日本，Yamato)，），BS-220 恒温水浴锅（日本，岛津），RE540-

10、AW 旋转蒸发仪(日本，Yamato)，树柱。2.3试剂无水乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、浓盐酸、氢氧化钠 （以上试剂为国产分析纯）。3实验部分3.1马比木喜树碱的提取取干燥马比木根粉碎混匀后,过40目筛，取一定量粉末置于1000ml的烧杯中用无水乙醇浸泡2-3天后过滤，滤渣再加无水乙醇浸泡2-3天后过滤，重复3-4次，合并滤液，得喜树碱提取液14。将喜树碱提取液置于旋转蒸发仪浓缩，温度为3715 。将浓缩液置于37真空干燥箱内干燥至质量不再变化，得喜树碱固体粗提物3.2大孔树脂预处理将新大孔树脂用95%的乙醇浸泡24 h使其充分溶胀,然后用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象,用蒸馏水除去乙醇;

11、再用5%盐酸浸泡12 h,除去破碎的颗粒,用5%HCl溶液冲洗树脂,用蒸馏水洗至中性;最后用5%NaOH浸泡12 h,除去破碎的颗粒,用5%NaOH溶液冲洗树脂,蒸馏水洗至pH值为中性16.。3.3静态吸咐3.3.1上样液浓度的选择分别取0.0109g、0.0205g、0.0306g、0.0403g、0.0505g、0.0609g喜树碱粗品，用1ml甲醇助溶17，配成浓度分别为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/m的喜树碱水溶液;将上述溶液分别加入到装有活化AB-8树脂5g的6个150ml三角瓶中，室温静态吸附24h，在UV-1

12、60A型紫外分光光度计上于254nm波长处测量上清液的吸光度，计算树脂对不同浓度的喜树碱溶液吸附率。A0A0吸附率(%) × 100A0：吸附前吸光值 A：吸附后吸光值3.3.2洗脱剂的选择分别取5.00g已吸附喜树碱的AB-8树脂4份于三角瓶中，分别加入甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇40ml,对其在常温下静止洗脱，每30分钟取一次上清液；测洗脱液在254nm处的吸光度。3.3.3洗脱剂浓度的选择分别称取5.00g已吸附了喜树碱的AB-8湿树脂8份置于150ml三角瓶中，分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液40ml，静置2h，在波长254

13、nm处测定各上清液的吸光度。3.3.4不同pH值对树脂吸附率的影响分别称取已活化的AB-8湿树脂5.00g，加入35mlpH值为4、5、6、7、8、9、10的喜树碱溶液，室温下静态吸附12h，在波长254nm处测量其上清液的吸光度，计算吸附率。3.3.5 温度对树脂吸附率的影响称取5.00g已活化AB-8湿树脂6份，分别加入40ml喜树碱溶液，分别在15、25、25、30、35、40、温度下静态吸附12h，在254nm处测量上清液的吸光度，计算吸附率。3.4动态吸附实验3.4.1上样流速对树脂吸附的影响将AB-8树脂浸没在蒸馏水中,按湿法装柱，树脂加到柱体积3/4后,再用蒸馏水反复过柱,装好的

14、树脂柱静止放置过夜,备用。取浓度为0.3mg/ml的喜树碱溶液流经AB-8树脂柱脂柱, 流速分别控制为10BV/h、15BV/h、20BV/h、25BV/h、30BVl/h,每10ml收集一管流出液,测定其吸光值A。3.4.2树脂吸附量的测定称取湿重为10g的AB-8树脂湿法装柱后，用蒸馏水反复过柱,装好的树脂柱静止放置过夜,备用。取喜树碱浓度为0.3mg/ml、PH=4的上样液在20上柱。每10ml收集一管流出液,测定其吸光值A。3.4.3脱流速的确定取上述确定的最佳洗脱液以最佳浓度流经装有饱和树脂的树柱，流速分别控制为10BV/h、15BV/h、20BV/h、25BV/h、30BVl/h,

15、 每10ml收集一管流出液,测定其吸光值A。4. 结论与讨论4.1上样液浓度的选择由图1知：随着喜树碱浓度的升高，树脂吸附率先有一个上升趋势，当浓度到0.3mg/ml时较好，随着喜树碱浓度的继续增大，则开始呈现下降的趋势，故选择浓度为03mg/ml的喜树碱溶液为最佳上样液。图1 不同喜树碱浓度下的树脂吸附率Fig.1 Resin adsorption rate of different camp tothecin concentration摘要与此处矛盾，且没有0.6mg/mL的数据4.2洗脱剂的选择由表1可知：30分钟时甲醇为最好的洗洗脱剂，30分钟后正丁醇和乙醇洗脱效果都很好。由于正丁醇相

16、对乙醇沸点高，价格贵，所以本文选乙醇洗脱剂.表1：洗脱剂的筛选Table 1 Election of eluant 洗脱液 各时段洗脱液吸光值 30 min 60 min 90 min甲醇 3.914 3.976 3.976乙醇 3.473 3.936 3.941丙酮 3.759 3.853 3.904正丁醇 3.473 4.019 4.0344.3洗脱剂浓度选择结合目标化合物极性与乙醇的特点，根据柱层析吸附与解吸附原理，实验选择不同体积分数的乙醇为洗脱剂，结果见图3 ，随着乙醇体积分数的升高，洗脱效果先有一个上升趋势，到乙醇体积分数70% 时，随着乙醇体积分数的继续增大，洗脱效果趋上平稳。为

17、工艺生产节约成本，故本文选用体积分数为70%的乙醇为较佳洗脱剂浓度. 图2 乙醇体积分数对解吸咐的影响效果Fig.2 Effect of ethanol concentration on desorption percentage ofRPCF fromAB-8 resin4.4不同pH值对树脂吸附率的影响由图3 可见，上样液的pH 值对吸咐率有影响， 当PH为4时，吸附效果最好，增大PH值吸咐率下降。由于强酸性对工业生产要求严格，不利于生产，所以本文末继续探究PH小于4的吸附情况，选择PH=4为是佳上样PH。 由图3 不同pH值对树脂吸附率的影响 Fig.3 Effect of pH val

18、ue of sample solution on adsorptionpercentage of RPCF onto AB-8 resin4.5温度对树脂吸附率的影响温度影响树脂吸附效果，结果如图4，当温度升高，树脂的吸附率增加，当温度为20时吸附效果最明显，继续升高温度，吸附率下降。故20为最佳上样温度. 图4 温度对树脂吸附率的影响Fig.4 The effect of the AB-8resin absorption from the diffreent temperature4.6上样流速对树脂吸附的影响由图5可以看出 , 在一定范围内,随着上样流速的增大，泄漏提前，当上样液流速为15

19、BV/H时, 喜树碱在500ml处泄漏，当上样液流速为20BV/H时，大约在440ml处泄漏，当流速为25BV/H和30BV/H时喜树碱大约在300ml处泄漏。随流速的增大,树脂周围的喜树碱分子过多, 使得部分喜树碱没来得及被吸附就流出来, 树脂的吸附量降低。但流速过慢不得于生产，故上样液流速确定为20BV/H. 图5 不同上样流速与树脂吸附效果关系Fig.5 The relationship between different sample velocity and effect of resin adsorption4.7 树脂吸附量的测定 由图6可知：以喜树碱浓度为0.3mg/ml样液上

20、样，流出液的吸光值在500ml处有渗漏，当上样液体积大概在820ml处吸光值不再增加，树脂吸附饱和。每克树脂的吸附量约为24mg. 图6 上样液体积与吸光值的关系 Fig.6 The relationship between sample liqwid valne and absorb light value4.8洗脱流速的确定由图5可知，洗脱液的吸光值随着洗脱液体积的增加出现先平缓再下降下平缓的规律。洗脱相同质量的喜树碱，不同流速洗脱时所用的乙醇体积不同。当洗脱流速为25BV/H时，曲线大约在720ml处开始平缓，所用的乙醇体积最少。所以以25BV/H为最佳洗脱流速。 图7 不同洗脱流速与洗

21、脱效果的关系 Fig.7 Effect of elution rate on desorption percentage of RPCFfrom AB-8 resin4结论实验采用静、动态吸附实验，选用AB-8型大孔树脂喜树碱的吸附树脂;调节喜树碱溶液的浓度为0.3mg/ml,pH值为4左右,在20通过上柱动态吸附,并控制吸附流速为20BV/H;每克树脂的吸附量为24mg.吸附完毕后用75%的乙醇洗脱,洗脱效果明显。综上所述,用AB-8型大孔树脂分离纯喜树碱,其工艺较简单、收率高、成本低,适合工业化生参考文献1 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志第四十六卷M . 北京:科学出版社,

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