碱性成纤维细胞生长因子促进脊髓损伤小鼠内源性神经干细胞的增殖

1、www.CRTER.org李宇博，等. 碱性成纤维细胞生长因子促进脊髓损伤小鼠内源性神经干细胞的增殖碱性成纤维细胞生长因子促进脊髓损伤小鼠内源性神经干细胞的增殖李宇博1，丁立祥2(1首都医科大学附属北京朝阳医院骨科，北京市 100020；2首都医科大学附属北京世纪坛医院脊柱外科，北京市 100038)引用本文：李宇博，丁立祥. 碱性成纤维细胞生长因子促进脊髓损伤小鼠内源性神经干细胞的增殖J.中国组织工程研究，2016，20(23):3476-3483.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.020 ORCID: 0000-0003-0850-525X(李宇博

2、)文章快速阅读：碱性成纤维细胞生长因子促进脊髓损伤小鼠内源性神经干细胞的增殖李宇博，男，1988年生，北京市人，汉族，2015年首都医科大学毕业，硕士，医师，主要从事脊柱外科研究。通讯作者：李宇博，首都医科大学附属北京朝阳医院骨科，北京市100020中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)23-03476-08稿件接受：2016-04-04在术后第7天再次实施手术，于L1节段置入浸润荧光金的无菌明胶海绵腹腔内注射溶有碱性成纤维细胞生长因子(25 g/kg)的含1%白蛋白的MTPBS碱性成纤维细胞生长因子可以促进损伤后内源性神经干细胞的增殖，并进一步增加神经

3、元数量，改善运动功能荧光金标记的神经元计数明显增加Nestin阳性的内源性神经干细胞计数明显增加Rotarod测试和Platform测试运动功能明显增高二者存在明确的线性关系脊髓损伤昆明小鼠 文题释义：荧光金：荧光金系脂溶性染料，能标记细胞质，在紫外线(323 nm)激发下发金黄色光(408 nm)，属慢速轴浆运输类，细胞核不着色，能很好地显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏不易扩散。与周围组织分界清晰。此染料在细胞质内的存在不超过3周。脊髓损伤轴突再生障碍：最近研究表明，脊髓损伤后轴突的再生失败是由多种原因造成的，包括缺少相应物质以支持轴突接触并通过相应损伤部位，损伤区域产生的细胞外基质及髓鞘

4、形成相关的抑制因子，缺少相应的神经刺激，成年人神经元的内在生长能力缺乏，以及广泛的二次损伤所引起的炎性反应等，共同引起轴突再生障碍。摘要背景：目前对于脊髓损伤的治疗主要以激素冲击及手术解除压迫为主，但是对已损伤的神经元无特效疗法。神经生长因子及内源性神经干细胞的应用，可以使神经元再生、轴突再髓鞘化，为脊髓损伤的治疗提供了新思路。目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖的影响及其与荧光金标记神经元数量增加的相关性。方法：昆明小鼠48只随机分为正常组、脊髓损伤组、治疗组、假手术组。脊髓损伤组、治疗组建立急性脊髓损伤模型，正常组仅实施手术而不损伤脊髓，在脊髓损伤后恢复意识2

5、h起开始，治疗组每日腹腔内注射溶有碱性成纤维细胞生长因子(25 g/kg)的含1%白蛋白的MTPBS。在第7天对前3组小鼠再次实施手术，于L1节段置入浸润荧光金的无菌明胶海绵，假手术组不进行处理。运用Rotarod和Platform Hang实验对小鼠的运动能力进行测试，使用荧光金对小鼠皮质脊髓束和红核脊髓束中的神经元进行标记计数，通过免疫组化检测nestin阳性内源性神经干细胞的数量，同时分析荧光金标记的神经元数量与内源性神经干细胞数量间的相关性。结果与结论：碱性成纤维细胞生长因子可显著改善受伤小鼠的运动功能，经碱性成纤维细胞生长因子处理后内源性神经干细胞数量明显升高，且与荧光金标记的神经元

6、数量的增加存在相关性；结果表明，碱性成纤维细胞生长因子在脊髓损伤后内源性神经干细胞的增殖过程中起着重要作用，而内源性神经干细胞通过增加再生神经元的数量使运动功能得到恢复。3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083关键词：干细胞；神经干细胞；脊髓损伤；神经生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；内源性神经干细胞；国家自然科学基金主题词：脊髓损伤；成纤维细胞生长因子2；神经干细胞；组织工程基金资助：国家自然科学基金青年项目(31300923)Basic fibroblast growth factors promote proliferation of endog

7、enous neural stem cells after spinal cord injury in miceLi Yu-bo1, Ding Li-xiang2 (1Department of Orthopedics, Affiliated Beijing Chaoyang Hospital of Capital Medical University, Beijing 100020, China; 2Department of Spine Surgery, Affiliated Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University,

8、Beijing 100038, China)AbstractBACKGROUND: So far steroid pulse therapy and surgical decompression are the main accepted therapies for spinal cord injury, but these methods make no effects on injured neurons. Nerve growth factors and endogenous neural stem cells play a role in the neuronal regenerati

9、on and remyelination, which provides a new idea for spinal cord injury treatment.OBJECTIVE: To explore the effect of the basic fibroblast growth factor on proliferation of endogenous neural stem cells after spinal cord injury and to analyze its relationship with the increased fluoro-gold labeled neu

10、rons.Li Yu-bo, Master, Physician, Department of Orthopedics, Affiliated Beijing Chaoyang Hospital of Capital Medical University, Beijing 100020, ChinaCorresponding author: Li Yu-bo, Department of Orthopedics, Affiliated Beijing Chaoyang Hospital of Capital Medical University, Beijing 100020, ChinaME

11、THODS: Totally 48 Kunming mice were randomly divided into four groups including normal, spinal cord injury, treatment and sham operation groups. Acute spinal cord injury models were established in the spinal cord injury and treatment groups, and the normal group was subjected to operation that did n

12、ot damage the spinal cord. At 2 hours after regaining consciousness, the treatment group was given daily injection of MTPBS containing 25 g/kg basic fibroblast growth factors and 1% album. And at 7 days, laminectomy was carried out again at the L1 segment in the former three groups and a small piece

13、 of sterile gelfoam soaked with fluoro-gold was inserted into the incision. The sham operation group was given no processing. Afterwards, mouse motor behavior was assessed using Rotarod and Platform Hang tests; neurons in the corticospinal and rubrospinal tracts were labeled with fluoro-gold; the nu

14、mber of endogenous neural stem cells positive for nestin was detected by immunohistochemistry method. Besides, the correlation between the number of fluoro-gold labeled neurons and the number of endogenous neural stem cells was assessed.RESULTS AND CONCLUSION: The basic fibroblast growth factor coul

15、d significantly improve the mouse motor behavior after spinal cord injury. And the number of endogenous neural stem cells was significantly increased after the basic fibroblast growth factor injection, which was related to the increased fluoro-gold labeled neurons. In conclusion, basic fibroblast gr

16、owth factors play an important role in the proliferation of endogenous neural stem cells after spinal cord injury. Furthermore, endogenous neural stem cells improve locomotive behaviors by encouraging the neuronal proliferation. Subject headings: Spinal Cord Injuries; Fibroblast Growth Factor 2; Neu

17、ral Stem Cells; Tissue EngineeringFunding: the Youth Project of National Natural Science Foundation of China, No. 31300923Cite this article: Li YB, Ding LX. Basic fibroblast growth factors promote proliferation of endogenous neural stem cells after spinal cord injury in mice. Zhongguo Zuzhi Gongchen

18、g Yanjiu. 2016;20(23): 3476-3483.3479ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction脊髓损伤后的功能丧失主要与不可逆的神经元死亡以及轴突的脱髓鞘有关，虽然在过去几十年有很多针对脊髓损伤的研究，但目前尚无令人满意的治疗方法。成年哺乳动物的内源性神经干细胞主要位于海马齿状回、嗅球、室管膜区、侧脑室壁、下丘脑、小脑皮质、大脑及脊髓的中线结构处1-2。当处于病理情况，例如脊髓损伤时，内源性神经干细胞会偏离原本的迁移方向，转而向损伤区域迁移并进行神经再生3。脊髓损伤可以极大的激活内源性神经干细胞增殖

19、分化潜能4，损伤后的第1天，激活的干细胞迅速增殖50倍，在损伤3 d后，大量增殖的干细胞离开中央管并迁移至损伤部位。在体外实验中，室管膜细胞可以迅速且大量的增殖成神经球5，并可进一步分化为神经元、少突胶质细胞以及星形细胞，新形成的神经元可填补损伤的区域，而形成的少突胶质细胞又可以促进轴突髓鞘的再生，轴突可逐渐长入空洞，填补损伤区域6。目前针对治疗脊髓损伤时内源性神经干细胞的诱导及募集方面，仍没有足够的研究。中间纤维是支撑细胞骨架的一种重要结构。Nestin是中间纤维家族中大小为240 ku的蛋白，属于型中间纤维蛋白，nestin主要高表达于未分化的细胞，尤其是内源性神经干细胞，并与细胞的未分化

20、状态、可塑性、迁移率以及病理状态有着密切联系7，而在已分化的细胞中表达明显下调8-9，因此实验可通过检测nestin阳性细胞的数量来表示内源性神经干细胞的数量。虽然在体外实验中内源性神经干细胞可以增殖分化为神经元及少突胶质细胞，但是在体内的内源性神经干细胞很少分化成少突胶质细胞且几乎不分化成神经元，其主要分化成星形胶质细胞，进而导致胶质瘢痕的形成10，造成这种情况的一个重要原因是由于缺乏神经生长因子的作用11。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors，bFGF/FGF-2)作为分裂原和化学诱导物是一种强有力的生长因子，在中枢神经受到损伤后，反应性星

21、形胶质细胞可以大量释放碱性成纤维细胞生长因子，同时损伤部位的碱性成纤维细胞生长因子受体的表达也明显上调12，碱性成纤维细胞生长因子可以阻止少突胶质细胞的凋亡、促进成熟的少突胶质细胞去分化和增殖，而且可以促进干细胞向少突胶质细胞分化13-14。虽然碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤修复所发挥的重要作用已被证实，但是对脊髓损伤后内源性神经干细胞的增殖情况是否产生影响，尤其是产生影响的程度等目前还不清楚。因此，实验旨在用荧光金逆向标记运动神经元判定脊髓损伤的程度，观察经碱性成纤维细胞生长因子干预前后内源性神经干细胞的增殖情况以及内源性神经干细胞增殖与荧光金标记的运动神经元数量的相关性。1 材料和方法

22、Materials and methods 1.1 设计 完全随机设计实验。1.2 时间及地点 实验于2013年5月至2014年9月在天津市第一中心医院卫计委重点实验室完成。1.3 材料 1.3.1 实验动物 昆明鼠48只，8周龄，雌雄各半，体质量25-30 g，购于天津实验动物中心。1.3.2 溶液配制 MTPBS：150 mmol/L NaCl， 16 mmol/L Na2HPO4，4 mmol/L NaH2PO4，pH=7.4。质量浓度50 g/L的碱性成纤维细胞生长因子溶液： 5 g的碱性成纤维细胞生长因子冻干粉溶于100 mL含有1%白蛋白的MTPBS。PBS：NaCl 8.5 g，

23、磷酸氢二钠30.8 g，磷酸二氢钠2.8 g，加蒸馏水至1 000 mL。碱性成纤维细胞生长因子促进脊髓损伤小鼠内源性神经干细胞增殖实验所用主要试剂：试剂来源重组人碱性成纤维细胞生长因子(货号：CYT-218)ProSpec荧光金Fluorochrome, Denver, CO抗荧光猝灭剂DAKO, California, U.S.A.不含DEPC的多聚甲醛(货号AR1068)博士德生物异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate isomer， FITC)标记的山羊抗小鼠二抗、nestin兔抗鼠一抗、抗体稀释液、封闭用正常山羊血清北京博奥森生物技术有限公司碱性成纤维细

24、胞生长因子促进脊髓损伤小鼠内源性神经干细胞增殖实验所用主要仪器：仪器来源series8-755 Rotarod转棒仪北京自然基因科技有限公司LHS-100CH恒温恒湿箱上海一恒科技有限公司荧光显微镜(ECLIPSE Ti-U 多端口倒置显微镜)Nikon公司YD-1900冷冻切片机益迪医疗设备有限公司动物手术显微镜上海普丹光学仪器有限公司BCD-206TASJ低温冰箱青岛海尔股份有限公司1.4 实验方法1.4.1 实验动物分组 将48只昆明种小鼠随机分成4组，每组有雌、雄鼠各6只，分别为正常组、脊髓损伤组、治疗组、假手术组。1.4.2 手术方法 对脊髓损伤组和治疗组小鼠用5%水合氯醛以4 mg

25、/kg的量进行腹腔内注射麻醉，以手捏小鼠下肢时，大腿无回缩反应为麻醉成功标志。麻醉后以T12为中心进行备皮，用碘伏对手术区域消毒。沿背部正中切口切开皮肤约1 cm，依次分离皮下组织、肌肉，以暴露2个或3个棘突。寻找尾端起倒数第二个有胸肋关节的椎体，即为T12椎体。用眼科剪将T12处的棘突和椎板整体掀起以暴露该处脊髓。用1 mL针头紧贴脊髓后正中动脉右缘垂直进针，形成由背侧至腹侧的垂直通道，用显微剪沿垂直通道至脊髓右侧缘行脊髓半切；切断左侧脊髓后索内的皮质脊髓束；在左侧脊髓腹侧横断，以切断左侧皮质脊髓前束。通过以上3步，可以获得永久性的T12水平右侧红核脊髓束及双侧皮质脊髓束的离断。温生理盐水清

26、洗伤口，分层缝合肌肉、结缔组织、皮肤。所有小鼠术后均可独立进食水，麻醉苏醒后可以尿便。术后第1天观察小鼠右后肢是否可以活动，完全不能活动者为模型建立成功。对脊髓损伤组和治疗组，在脊髓损伤术后恢复意识2 h起开始进行治疗，分别予以每日腹腔内注射含1%白蛋白的MTPBS、溶有碱性成纤维细胞生长因子(25 g/kg)的含1%白蛋白的MTPBS (MTPBS为碱性成纤维细胞生长因子的良好溶剂，白蛋白可以保护碱性成纤维细胞生长因子)，共注射14 d。在术后第7天再次行手术，在L1节段行椎板切开术，手术方法同前，将一块大小为0.3 mm×0.3 mm用0.2 mL 4%荧光金试剂浸润的无菌明胶海

27、绵置入脊髓伤口内，分层缝合伤口，方法同前。正常组小鼠不损伤脊髓，仅行2次手术，步骤同前，术后给予腹腔注射含有1%白蛋白的MTPBS，并在第2次手术时于L1节段将0.3 mm×0.3 mm用0.2 mL 4%荧光金试剂浸润的无菌明胶海绵塞于背侧脊髓内。对假手术组不行任何手术操作，也不置入荧光金。1.4.3 运动功能测试 从第1次手术结束当天即开始，对所有小鼠每隔1 d进行1次Rotarod测试和Platform测试，共测试8次。实验在行脊髓损伤前，对所有小鼠进行了7 d适应性训练，室温为(24±2) ，湿度为(50±5)%，每次实验均在上午11点进行，实验前用体积分

28、数为75%医用乙醇擦洗转棒以消除其他种系小鼠的气味。Rotarod测试：测试标准为评价每只小鼠在转棒仪的滚轮上所能坚持的时间(滚轮直径3.6 cm，设置转速为匀速16 r/min)，180 s后无论是否从滚轮掉下均终止实验，连续进行3次测试，每次间隔15 min，最后取3次的平均值作为最终结果。Platform测试：将小鼠的前肢置于透明塑料板的边缘，双下肢自然悬空下垂，下方放置软垫以防摔伤，测量小鼠右后肢(治疗组和脊髓损伤组右后肢瘫痪)向上移动的距离。1.4.4 实验取材及组织处理 在脊髓损伤后第14天，对所有小鼠腹腔注射200 mg/kg的致死量戊巴比妥钠。剪开右心耳并用生理盐水冲洗血液，待

29、右心耳流出无色清亮液体后，迅速用40 g/L多聚甲醛心脏灌注，至小鼠肝脏变白时停止。取小鼠的大脑、脑干组织，用生理盐水冲洗后置于40 g/L多聚甲醛固定液中，4 过夜。固定后的组织在梯度浓度的蔗糖溶液中进行脱水，然后将组织放入液氮罐冷冻30 s，放入冰冻切片机复温20 min后进行切片。沿组织冠状位进行切片，厚度为 10 m，每10个切片收集1个。将组织切片贴片于明胶包被的载玻片上，自然风下进行风干，在二甲苯中浸润20 s后用非荧光中性封固剂(DPX)进行封固。在荧光显微镜下，使用宽带紫外激发滤光片进行观察，可见荧光金标记的神经元呈现蓝色，NIS-Elements 2.10软件获取图像，取10

30、0倍图像用Image Pro Plus5.1图像分析软件对标记的神经元进行计数，结果用±s表示。1.4.5 Nestin免疫组化 将切片复温到室温。用 0.01 mol/L PBS冲洗3 min×3次。体积分数为5%山羊血清室温下封闭20 min。滤纸吸干山羊血清后，加兔抗鼠nestin一抗(1200)50 L，4 下过夜。0.01 mol/L PBS冲洗3 min×3次。加入1200稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗工作液，37 避光孵育2 h。0.01 mol/L PBS洗3 min×3次，用抗荧光猝灭剂封固，在荧光显微镜下观察nestin阳性免疫荧光标

31、记的内源性神经干细胞。1.5 主要观察指标 Rotarod测试中小鼠所坚持的时间。Platform测试中小鼠爬行距离。各组小鼠脑皮质及红核切片中荧光金标记的运动神经元数量。各组小鼠nestin阳性的内源性神经干细胞数量。1.6 统计学分析 所有数据及图形均通过GraphPad Prism(Version 4.0，GraphPad Software Inc.，San Diego，USA)处理，数据统计值用±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 共48只小鼠用于实验，实验过程中无

32、脱落，均进入结果分析。2.2 运动功能测试结果 通过Rotarod(表1)及Platform Hang(表2)两种运动功能测试发现，脊髓损伤组小鼠运动功能明显下降，经碱性成纤维细胞生长因子干预后运动功能均明显增高，正常组及假手术组小鼠运动功能未见明显改变。2.3 荧光金标记的神经元计数 荧光金标记实验分别检测红核及脑皮质处的神经元(图1)，结果可见正常组小鼠皮质脊髓束及红核脊髓束神经元均可充分标记，脊髓损伤组小鼠皮质脊髓束及红核脊髓束神经元仅有极少量标记，经过碱性成纤维细胞生长因子干预的小鼠荧光金标记神经元有明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。表1 各组小鼠Rotar

33、od实验测评结果 (±s，n=12，s)Table 1 Rotarod test of mice in each group时间(d)正常组脊髓损伤组治疗组假手术组0175.75±7.230.000.00169.75±6.342175.00±7.075.75±3.3018.25±7.68167.75±10.284175.75±5.6811.00±3.9256.50±21.02a171.00±10.526166.75±25.1812.25±12.6079.25

34、7;31.53b173.25±5.748177.25±3.5914.00±13.3990.00±34.19b173.00±5.9410177.25±5.5015.25±19.94107.50±20.74b175.25±6.9512175.25±7.0116.75±17.1779.25±24.80b161.00±23.814178.00±2.4514.50±9.2982.50±34.45b174.50±6.56表注：脊髓损伤组小

35、鼠出现了永久性的后肢瘫痪，而治疗组相比于脊髓损伤组，测试结果有显著性提高(aP < 0.05，bP < 0.01)，正常组和假手术组的结果未受明显影响。表2 各组小鼠Platform Hang实验测评结果(±s，n=12，cm)Table 2 Platform Hang test of mice in each group表注：脊髓损伤组小鼠出现了永久性的后肢瘫痪，而治疗组相比于脊髓损伤组，测试结果有显著性提高(aP < 0.01)，正常组和假手术组的结果未受明显影响。时间(d)正常组脊髓损伤组治疗组假手术组08.63±0.480.000.008.29&#

36、177;0.6528.88±0.250.75±0.501.25±0.658.52±0.5948.50±0.410.88±0.483.63±0.57a8.13±0.6368.75±0.501.50±0.714.50±0.81a8.50±0.4188.13±0.630.88±0.484.75±0.43a8.38±0.48108.75±0.291.13±0.324.75±1.32a8.25±0.8712

37、9.00±0.481.75±0.295.25±0.62a8.38±1.03148.75±0.291.25±0.875.25±1.04a8.38±0.48图1 皮质脊髓束与红核脊髓束中荧光金标记的神经元(标尺为100 m)Figure 1 Fluoro-gold labeled neurons in the corticospinal and rubrospinal tracts of each group (scale bar=100 m)图注：图中A-D分别为正常组，脊髓损伤组，治疗组及假手术组皮质脊髓束中的神经

38、元，E-H分别为正常组，脊髓损伤组，治疗组及假手术组红核脊髓束中的神经元。表4 各组小鼠运动皮质内Nestin阳性的内源性神经干细胞计数 (±s，n=48)Table 4 The number of endogenous neural stem cells positive for nestin in the mouse motor cortex of each group 组别皮质脊髓束红核脊髓束正常组8.50±1.763.75±1.80脊髓损伤组84.75±13.21a47.50±6.51a治疗组134.80±18.20b75.3

39、3±6.10b假手术组7.58±8.502.50±2.65表注：与正常组比较，aP < 0.05；与脊髓损伤组比较，bP < 0.05。表3 各组小鼠荧光金标记的神经元计数 (±s，n=48)Table 3 The number of fluoro-gold labeled neurons in the corticospinal and rubrospinal tracts of mice in each group组别皮质脊髓束红核脊髓束正常组2 519.00±118.10875.80±38.40脊髓损伤组898.80

40、±57.30a301.30±25.02a治疗组1 513.00±57.62b489.30±22.12b假手术组00表注：与正常组比较，aP < 0.05；与脊髓损伤组比较，bP < 0.05。表5 内源性神经干细胞与荧光金标记的神经元的相关性分析 Table 5 The correlation between endogenous neural stem cells and fluoro-gold labeled neurons组别皮质脊髓束红核脊髓束脊髓损伤组P=0.155 3，r=0.437 1P=0.403 1，r=0.266 1治疗组

41、P=0.035 7，r=0.608 7P=0.003 0，r=0.775 52.4 Nestin阳性的内源性神经干细胞计数 运动皮质和红核脊髓束内源性神经干细胞免疫荧光实验发现(表4)，脊髓损伤组小鼠脊髓损伤后红核及大脑皮质部位出现大量内源性神经干细胞增殖，同时发现经碱性成纤维细胞生长因子干预后内源性神经干细胞数量进一步明显增加，与脊髓损伤组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。相反，正常组及假手术组仅发现少量内源性神经干细胞。相关性分析发现，经碱性成纤维细胞生长因子干预后，运动皮质和红核脊髓束内源性神经干细胞增多，与荧光金标记的神经元数量增加有明显正相关性(表5)；相反脊髓损伤组小

42、鼠上述分析未发现有相关性。3 讨论 Discussion研究小鼠脊髓损伤后功能修复的一个重要前提就是制作可靠的动物模型，作者通过查阅文献，使用已被证实有效的小鼠模型，可以使小鼠单侧后肢瘫痪同时又不影响其排尿、排便功能15，该模型在脊髓损伤后可以造成长期且稳定的肢体瘫痪，并通过Rotarod测试和Platform测试加以验证。在实验中，小鼠双侧的皮质脊髓束和右侧的红核脊髓束被完全切断，而左半侧的红核脊髓束则完全保留。实验使用上述脊髓损伤模型研究碱性成纤维细胞生长因子在脊髓损伤治疗中的效果，脊髓损伤组中运动神经元数量较正常组有明显下降，虽然仍保存有一定数量的神经元，但并不足以维持小鼠正常的运动功能

43、；治疗组中的运动神经元数量相较脊髓损伤组有明显升高，虽然没有恢复到正常水平，但此增加幅度足以改善小鼠的运动功能，说明碱性成纤维细胞生长因子在改善脊髓损伤小鼠运动功能、维持运动神经元数量方面存在明确的治疗效果。实验假定运动功能的恢复以及运动神经元数量的增加，均是由于损伤的皮质脊髓束和红核脊髓束中的轴突再生以及再髓鞘化的结果，由此认为，碱性成纤维细胞生长因子在防止损伤后少突胶质细胞的死亡、促进轴突再生和突触形成方面起着重要的作用。很多相关研究支持了这一推断，例如，Kang等16发现在损伤的神经皮质中，碱性成纤维细胞生长因子可以抑制星形胶质细胞的过度表达，在脊髓损伤时，神经元会分泌碱性成纤维细胞生长

44、因子，其通过胞外的ERK通路增强小胶质细胞迁移和吞噬神经碎片的作用，并起到抗谷氨酸盐细胞毒性的神经保护作用；同时碱性成纤维细胞生长因子刺激内源性神经干细胞的增殖并促进干细胞向少突胶质祖细胞分化，增加白质和皮质中少突胶质细胞的数量17；Thau-Zuchman等18研究额顶叶皮质损伤小鼠模型时发现，通过持续性侧脑室灌注碱性成纤维细胞生长因子，可以明显改善小鼠的运动功能，促进损伤皮质周围区域的的星形胶质细胞增殖及新生血管的数量增加，并最终促进内源性神经干细胞的分化；少突胶质细胞上的碱性成纤维细胞生长因子受体还可以通过ERK1/2-MAPK通路调节新生髓鞘的数量及厚度，在髓鞘形成过程中减少碱性成纤维

45、细胞生长因子受体会使新生髓鞘的数量及厚度明显减小，如髓鞘已形成，碱性成纤维细胞生长因子受体的减少则使主要髓鞘基因的表达明显减少19；碱性成纤维细胞生长因子介导的神经营养体系还为神经再生创造了一个有利的微环境20。实验同时揭示了小鼠红核及大脑皮质处存在大量内源性神经干细胞，内源性神经干细胞大量再生的治疗组，其愈后也明显好于无神经元再生的脊髓损伤组。这一发现表明内源性神经干细胞在脊髓损伤后被激活，并与其后的病理过程和神经再生有着密切的联系。目前已有若干研究报道了内源性神经干细胞在不同疾病中的作用，例如，在肌萎缩侧索硬化小鼠模型中，内源性神经干细胞在发病初期被激活并在疾病发展过程中数量显著增加，增殖

46、的内源性神经干细胞主要分化为星形胶质细胞，只有一小部分分化成神经元及少突胶质细胞21-22。但是过多的星形胶质细胞并不利于髓鞘的再生，其形成的胶质瘢痕亦会阻碍轴突的生长，并且会增强感觉性轴突的塑性从而导致痛觉过敏23-24。内源性神经干细胞还可以改善阿尔茨海默病患者的认知功能25。治疗组小鼠在红核及大脑皮质处可以发现内源性神经干细胞的数量相较脊髓损伤组有明显增加，这一结果进一步证实了碱性成纤维细胞生长因子是脊髓损伤后影响内源性神经干细胞增殖的重要因素。由于内源性神经干细胞在体内主要分化为神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞，且经碱性成纤维细胞生长因子处理后小鼠运动功能有明显改善，因此有理由推断，

47、通过碱性成纤维细胞生长因子作用后，内源性神经干细胞更多地向运动神经元和少突胶质细胞方向分化。目前已经证实在成人中枢神经系统的神经生成过程中，碱性成纤维细胞生长因子的表达与内源性神经干细胞及祖细胞的增殖和分化有着密切的关系26；在急性应激过程中，碱性成纤维细胞生长因子会增强海马齿状回颗粒下层的神经生成作用，在该处的内源性神经干细胞表面高度表达的FGFR1是海马内源性神经干细胞增殖的基本条件之一27；当皮下注射碱性成纤维细胞生长因子后，新生小鼠小脑外颗粒层的颗粒祖细胞的数量增加了30%，侧脑室壁室管膜下区的和海马处的DNA合成也显著增加28；Dono等29认为碱性成纤维细胞生长因子对于祖细胞的促迁

48、移和促分化作用要大于其促增殖作用；这一观点也得到了Werner等人的肯定，其研究表明碱性成纤维细胞生长因子(-)的成年小鼠在海马齿状回处的内源性神经干细胞增殖能力并无明显缺陷，但神经祖细胞的分化过程却受到了明显损害26；Chang等30的研究表明碱性成纤维细胞生长因子可以使C6神经胶质瘤中的Nestin表达明显上调，这也与此研究中的结果一致。碱性成纤维细胞生长因子已被证实在多种疾病中具有治疗作用，例如可以增强帕金森小鼠的神经元生存力，保护黑质处的神经元免受6-羟多巴胺介导的细胞毒性的伤害31；在多发性硬化，尤其是临床复发患者的脑脊液中明显升高，提示碱性成纤维细胞生长因子可能存在神经保护作用。实

49、验发现碱性成纤维细胞生长因子可以改善损伤小鼠的运动功能，同时增强内源性神经干细胞的增殖能力。因此，作者分析了皮质脊髓束和红核脊髓束中荧光金标记的神经元的数量，与相应位置的内源性神经干细胞数量的关系，治疗组的内源性神经干细胞数量与皮质脊髓束和红核脊髓束中荧光金标记神经元的数量存在明确的线性关系，但是在脊髓损伤组中并不存在线性关系。这些结果强调了碱性成纤维细胞生长因子可以促进内源性神经干细胞与运动神经元间的相互作用，并最终表现为运动功能的改善。虽然实验发现碱性成纤维细胞生长因子可以促进损伤后内源性神经干细胞的增殖，并进一步增加神经元数量，改善运动功能，并且有大量相关文献支持，但并非所有研究都对碱性

50、成纤维细胞生长因子的作用持积极观点，例如通过研究缺乏FGFR1和FGFR2的转基因小鼠，发现其少突胶质细胞系的增殖和分化与正常小鼠无明显差别19；另一项研究则指出碱性成纤维细胞生长因子对于少突胶质细胞祖细胞的分化是起抑制作用的32。结合此研究结果和相关文献，有理由认为碱性成纤维细胞生长因子在体内可能存在一个最佳浓度值，同时也可能存在一临界浓度值，当高于或低于这一临界值后，碱性成纤维细胞生长因子将会产生相反的效果，但这还需要进一步的研究。结论：实验重点集中于脊髓损伤后的神经元激活问题上，证明了在脊髓损伤后，虽然内源性神经干细胞会被激活，但数量非常有限，很重要的一个原因就是体内缺乏可促进神经元再生

51、、少突胶质细胞存活以及轴突再髓鞘化的生长因子，并最终导致功能恢复障碍。然而，实验发现碱性成纤维细胞生长因子在维持运动神经元数量以及促进内源性神经干细胞增殖方面起着重要的作用，碱性成纤维细胞生长因子通过促进内源性神经干细胞与运动神经元间的相互作用使小鼠运动功能明显改善。但是碱性成纤维细胞生长因子是如何使内源性神经干细胞和运动神经元间相互作用的，以及脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖、分化的机制仍不十分清晰，并且运动功能的恢复并未达到理想状态，因此下一步研究应围绕碱性成纤维细胞生长因子的作用机制，以及如何更好的发挥其作用以期满足临床的需要。致谢：感谢天津市第一中心医院卫计委重点实验室的技术支持。作者贡

52、献：实验设计、实施以及资料收集为李宇博，技术指导为丁立祥。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethicalissues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署

53、了版权相关协议。4 参考文献 References1 Kempermann G, Wiskott L, Gage FH. Functional significance of adult neurogenesis. Curr Opin Neurobiol. 2004;14(2):186-191.2 Liu J, Zang D. Response of neural precursor cells in the brain of Parkinson's disease mouse model after LIF administration. Neurol Res. 2009;31(7)

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