CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

1、CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响         11-03-31 13:03:00     作者：霍晓川    编辑：studa20【摘要】  目的 应用反义RNA技术特异性下调结缔组织生长因子(CTGF)的表达，观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制。方法 培养原代VSMC，使用脂质体法将携带有CTGF反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染入VSM

2、C，Western Blot技术观察CTGF的表达以及蛋白激酶B(Akt)的活性，MTT法及划痕试验测定VSMC增殖和迁移情况。结果 pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染VSMC后CTGF的表达明显降低，Akt的活性降低，VSMC的增殖和迁移受到明显抑制。结论 应用反义RNA技术可特异性下调CTGF表达，并通过降低Akt的活性抑制VSMC的增殖和迁移。 【关键词】  血管平滑肌细胞 结缔组织生长因子 细胞增殖 细胞迁移 反义RNA    Abstract：Objective  To specifically down-regulate t

3、he expression of CTGF by applying anti-sense RNA technique and observe its effect on proliferation and migration of VSMC. Methods  Primary VSMCs were cultured by adherence method. Anti-sense RNA technique was applied to specifically down-regulate the expression of CTGF. Expression of CTGF and a

4、ctivity of Akt were detected by WB. Proliferation and migration of VSMC were determined by MTT and scratch assay. Results  Transfer of pcDNA 3.1(+)-CTGF(-) could specifically down-regulate CTGF expression and the activity of Akt. The proliferation and migration of VSMC were inhibited. Conclusio

5、ns   Specific down-regulation of CTGF expression by anti-sense RNA technique could inhibit the proliferation and migration of VSMCs by decreasing the phosphorylation of Akt.    Key words：vascular Smooth muscle cell (VSMC);connective tissue growth factor (CTGF);cellproliferat

6、ion;cell migration;anti-sense RNA    动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，AS)始于血管内膜损伤1。在AS发生前，常有多种因素的刺激对血管内膜造成损伤，内皮细胞发生功能性和器质性改变，造成通透性改变和分泌功能障碍，促进血液中的脂质进入动脉壁。内皮细胞和动脉中层的血管平滑肌细胞(vascular endothelial cell，VSMC)进一步激活，大量合成并分泌多种生长因子，使自身和周围细胞大量增殖，增殖的VSMC还可迅速合成胶原等细胞外基质2，促使VSMC在损伤修复过程中发生纤维化，形成瘢痕修复，血管壁在结构和功

7、能上发生了变化，最终导致了AS的形成 3。    结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是从培养的人脐带静脉血内皮细胞的条件培养基中发现的。有研究表明4，CTGF参与了血管的损伤修复，能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成，促进AS的发展。AS病灶中CTGF的mRNA和蛋白质较正常的血管内有较高表达，可见CTGF在AS的发生和发展中有着重要意义5。    本课题旨在探讨CTGF在AS中对VSMC增殖和迁移的影响并明确其相关机制，为CTGF对动脉粥样硬化性血管狭窄病变过程的影响

8、提供实验依据。    1  材料与方法    1.1  实验材料    1月龄SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。CTGF反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CTGF(-)质粒由辽宁医学院科学实验中心构建。羊抗大鼠CTGF多克隆抗体， ECLTM 显影液，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(美国Santa Cruz 公司);Akt和磷酸化Akt抗体，平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(美国Sigma公司);低糖DMEM 培养基(美国Gibco 公司);小牛血清，胰蛋白酶(杭州四季青

9、生物工程公司);其他试剂均为国产分析纯产品。    霍晓川，等：CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响辽宁医学院学报  2008年2月，29(1)1.2  实验方法    1.2.1  VSMC的培养和鉴定    处死大鼠浸于75%乙醇中消毒10 min。无菌状态取出双侧颈总动脉，去除血管外结缔组织，剖开血管，刮去内膜，剥离外膜，将中膜剪成1 mm2左右的组织块植入经明胶包被处理的培养皿中，种植密度约为1块/cm2，37 、5%CO2的培养箱培养倒置培养2 h，待

10、组织块贴壁后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，培养1周左右，待细胞爬出融合后，用0.125%的胰蛋白酶进行消化、传代，VSMC镜下见典型的“谷峰样”生长特点，平滑肌肌动蛋白(-actin)免疫细胞化染色阳性，证实为VSMC。选35代对数生长期VSMC进行实验。    1.2.2  实验分组    取培养第35代的VSMC细胞30瓶（5×104mL），随机分为组：反义RNA组，对照组及空白组，每组10瓶细胞。分别实施pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染、空白脂质体转染以及空白处理。  

11、  1.2.3  pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染VSMC    转染前更换无血清培养基，待VSMC生长到50%60%后，加入含有4 g pcDNA3.1(+)-CTGF(-)的转染复合物，置于37 ，5%CO2培养箱孵育。4 h后移除转染复合物，加入无血清培养基，置于37 ，5%CO2培养箱孵育48 h后，备用于指标检测。    1.3  指标检测    1.3.1  Western blot检测组细胞CTGF表达和Akt磷酸化状态。 

12、0;  取第35代VSMC长至次融合后，给予相应干预因素后，无血清DMEM培养24 h，使细胞统一于G0期，加入700 预冷的改良RIPA裂解缓冲液(Tris-HCl， 50 mmol/L， pH7.5;NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%;脱氧胆酸钠，0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1.0 mmol/L; PMSF，1.0 mmol/L; Leupeptin， 2.0 g/m)裂解细胞，冰浴30 min，其间不时摇晃培养瓶;收集细胞，10 000 g4 离心15 min，上清液即为细胞提取物，保存样品于-20 备用。BCA-100蛋白质定量测定试剂盒检

13、测总蛋白浓度。按分子克隆的操作进行免疫印迹杂交测定:取样本30 g进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。1:500稀释的抗CTGF多抗杂交4 过夜，1:5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗杂交1 h，ECL显影液放射自显影，以20 min曝光时间较佳。图像分析由Total Lab分析软件进行光密度扫描。    1.3.2  甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测各组VSMC增殖情况    第3代VSMC按5×104/mL接种于96孔培养板上，每孔0.1 mL，培养24 h后进行各分组的相应处理，测定前2 h加入MT

14、T，置于37 孵育箱中保温2 h以上，弃去上清液，加DMSO 150 L/孔，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm 处测定OD值。每培养板接种12孔，每天取1板，连续测7 d，绘出生长曲线。    1.3.3  划痕实验检测各组VSMC迁移情况    各组细胞接种于在35 mm的培养皿中(2×105/mL)，待细胞汇合成单层用灭菌移液器头在细胞上小心的做一个划痕，PBS彻底漂洗3次，显微镜下拍照，然后加入含10 g/mL衣霉素的培养液继续培养，各组细胞于第24 h观察划痕愈合情况，显微镜下拍照，选取3个

15、不同的位置，用刻度尺测量划痕宽度，计算平均值，根据这些数值计算划痕愈合指数。划痕愈合指数(初始划痕宽度-愈合后划痕宽度)/初始划痕宽度。    1.4  统计学分析    各组细胞指标检测内容重复测量3次，所有数据以x±s表示，采用SPSS12.0软件，首先进行方差齐性检验，然后进行重复测量的方差分析进行比较分析，P0.05为有统计学意义。    2  结    果    2.1  原代VSMC形态及细胞特异性蛋白免疫组化的鉴定    倒置相差显微镜下单个平滑肌细胞呈梭形或带状，有多个细胞突起，胞浆丰富，胞质密度高，不透明，核卵圆形居中，有多个核仁。细胞生长致密时平行排列成束，部分重叠，表现为典型“谷峰状”生长。培养第5代的细胞经特异的平滑肌-actin