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文档简介

1、实验五 蛋白质浓度测定方法比较一实验目的：了解蛋白质浓度的测定方法(Lowry法、紫外线吸收法和考马斯亮蓝显色法)，并比较它们的优缺点。二Lowry法（Folin-酚法）： 1 实验原理：OH磷钼酸、磷钨酸Pr+CuSOPr-Cu 蓝色复合物蛋白测定范围：25-250ug/ml 测定波长：660nm 标准蛋白BSA 250ug/ml2试剂和器材： 3操作方法：（2）以A660nm-Pr 作标准曲线 ： 4实验结果：从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：116g/ml 三紫外线（UV）吸收法：方法一：作图法1实验原理：利用蛋白质在280nm的紫外吸收特性(蛋白测定范围：0.11mg/ml) 2

2、操作步骤：标准蛋白BSA 1mg/ml （1）向各试管中依次加入各种试剂：4实验结果：A280nm-Pr标准曲线A280nm0.20.4Pr(mg/ml)从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：0.128mg/ml 方法二：经验公式法分别测出待测蛋白A260、A280蛋白质浓度（mg/ml）1.45A280-0.74A260 或蛋白质浓度（mg/ml）1.55A280-0.76A260 四考马斯亮蓝显色法（Brad-forol法）：1 实验原理： Pr CBBG-250- Pr复合物 A595 测定Pr范围： 0250ug/ml标准蛋白BSA 250ug/ml 测定波长595nm 2试剂和器材

3、：考马斯亮蓝试剂；标准蛋白质溶液：250g/ml BSA；测试样品 试管及试管架，0.1及5ml吸量管，恒温水浴，722型分光光度计。 3操作步骤：（1）依次向各试管中加入各种试剂（2）以A595-Pr作出标准曲线： 4实验结果：595A从标准曲线上可求得待测蛋白浓度五、试验分析：Lowry法是双缩脲法的进一步发展，灵敏度高，可测定范围质因酪氨酸，色氨酸含量不同而使颜色强调不同，的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。紫外线吸收法大多数蛋白质在酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，量。如果没有干扰

4、物质的存在，溶液。它的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。缺点是不同蛋白质中酪氨酸，色氨酸含量不一样，测定结果误差大；核酸有强烈干扰；蛋白质紫外吸收值与有关。考马斯亮蓝法是检测生物制品总蛋白含量的理想方法，它方法简单，只需一种显色液；反应迅速，只需5大；线性关系不好。A595-Pr标准曲线0050100150200250300Pr(g/ml)(平均)：117g/ml 是一种可靠的蛋白质含量测定法。优点是操作简便，25250微克的蛋白质。缺点是有蛋白质特异性的影响，标准曲线也不是严格的直线形式。pH环境中才稳定，因此，福林试剂加入-磷钨酸试剂在未被破坏之前能280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含在280nm处的吸收可用于测定

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