虎杖苷对烧伤血清和LPS作用下大鼠平滑肌细胞蛋白激酶C活性的影响(一)

1、虎杖苷对烧伤血清和LPS作用下大鼠平滑肌细胞蛋白激酶C活性的影响(一)    作者：王月刚，金春华，黄海潇，吴平生【关键词】 虎杖苷基金项目：国家自然科学基金【Abstract】 AIM: To explore the mechanism of polydatin (PD) treating shock through studying the influence of PD on the activity of protein kinase C (PKC) of vascular smooth muscle cells (VSMC) when trea

2、ted by sera from burned rats and lipopolysaccharide (LPS). METHODS: After VSMC was treated by sera from burned rats or LPS, the activity of PKC was measured by scintillation counting instrument. RESULTS: Activity of PKC of VSMC cytoplasm after treated by sera from burned rats decreased (P0.05 vs nor

3、mal group), but activity of PKC of cell membrane increased (P0.05 vs normal group). When VSMC was treated with PD, the activity of PKC of VSMC cytoplasm increased and that of cell membrane decreased (P0.05 vs burned group and control group, P>0.05 vs normal group). However, the activity of PKC of

4、 VSMC cytoplasm and cell membrane treated by LPS increased (P0.05 vs normal group), after PD treated VSMC the activity of PKC decreased again (P0.05 vs LPS group and control group, P>0.05 vs normal group). CONCLUSION: PD antagonizes the damage effects of LPS and sera of burned rats by reversing t

5、he PKC activities, which may be one of the molecular mechanisms of PD antishock property.【Keywords】 burn; lipopolysaccharide; smooth muscle cell; polydatin; protein kinase C【摘要】 目的:观察虎杖苷(PD)对烧伤血清和脂多糖（LPS）作用下大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）蛋白激酶C（PKC）活性的影响，探讨其抗休克的机制. 方法:取大鼠胸主动脉培养VSMC，用烧伤血清和LPS刺激VSMC后，闪烁计数仪测定PKC活性. 结果：

6、 烧伤血清作用后VSMC胞质PKC的活性下降(vs正常组P0.05)，但胞膜的PKC活性上升（vs正常组P0.05），经PD治疗后胞质PKC的活性上升（vs烧伤组、治疗对照组P0.05，vs正常组P>0.05），胞膜的PKC活性下降（vs烧伤组、治疗对照组P0.05, vs正常组P>0.05）. LPS刺激后VSMC胞质与胞膜PKC的活性均上升（vs正常组P0.05），经PD处理后其活性又均下降（vs LPS组、治疗对照组P0.05，vs正常组P>0.05）. 结论： PD对烧伤血清和LPS作用下的VSMC的保护作用可能是通过调节PKC的活性来发挥作用的，这可能是其抗休克的分

7、子机制之一.【关键词】 烧伤；脂多糖；平滑肌细胞；虎杖苷；蛋白激酶C0引言虎杖苷(polydatin, PD)是从中药虎杖中提取的主要成份，在体动物实验表明PD对烧伤性、感染性休克有良好疗效，治疗休克动物的存活时间和存活率均明显优于6542和多巴胺1. 平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)在小血管的收缩扩张中占据着主导地位，而蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）的活性则对VSMC的收缩功能起着重要的调节作用2. 对于感染性休克来讲，细菌内毒素起了重要的作用，内毒素的主要成份为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，因此我们用LPS刺

8、激大鼠SMC来模拟感染性休克，同时，我们也应用烧伤血清刺激SMC来模拟烧伤性休克，观察了PD在此种情况下对SMC PKC活性的影响，以探讨PD抗休克的作用机制.1材料和方法1.1材料清洁级SD大鼠，40只，体质量180220 g，雌雄不拘，由南方医科大学实验动物中心提供. PD由校化学教研室提纯制备. LPS(浓度2.5 g/L)，磷脂酰丝胺酸（phosphatidylserine, PS）,组蛋白S型（histone）,苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）和Triton X100购自Sigma公司. 胎牛血清（杭州四季青公司）. 32PATP

9、, ATP(250 mmol/L), CaCl2, MgCl2, DTT, Hepes, 蔗糖，TrisHCl, EGTA, EDTA, 乌拉坦, 氯醛糖等均为国产试剂. PD用DHanks液配制成2 mmol/L，避光保存. PS用氯仿配制成2 g/L，避光贮于-20. PMSF用异丙醇配制成100 mmol/L，-20保存. LS6500型液体闪烁计数仪（Bechman公司，测量PKC的活性），低温高速离心机（Bechman Avanti J25, 提取PKC用）.1.2方法1.3分组实验分两部分，一部分为烧伤血清刺激，一部分为LPS刺激，n=5. 烧伤血清刺激分正常组（不加任何处理因素）

10、，烧伤组（大鼠烧伤血清刺激1 h，血清浓度为200 mL/L），治疗组（在烧伤组处理完毕后加PD治疗2 h，PD终浓度为0.4 mmol/L），治疗对照组（在烧伤组处理完毕后加与PD等量的DHanks，作用2 h）；LPS刺激分正常组（未做任何处理），LPS刺激组（加入LPS使其终浓度为100 g/L，刺激30 min），治疗组（在LPS刺激组基础上加PD，终浓度为0.4 mmol/L，作用2 h），治疗对照组（在LPS刺激组基础上加与PD等量的DHanks，作用2 h）.统计学处理： 结果用x±s表示，应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析.2结果2.1PD对烧伤血清刺激

11、后SMC胞质及胞膜PKC的影响胞质：烧伤组的PKC活性比先前有所下降，与正常组比较P0.05. 经PD治疗后PKC的活性有所上升，与烧伤组比较P0.05，与正常组相比P>0.05. 而治疗对照组的活性上升更高, 与烧伤组和治疗组比较P0.05. 胞膜：烧伤可以使胞膜PKC的活性上升，P0.05. 而经PD治疗后PKC的活性有所恢复，与烧伤组相比较P0.05. 而治疗对照组的PKC活性与治疗组相比较P0.05，与烧伤组比较P>0.05(表1).2.2PD对LPS刺激下SMC胞质及胞膜PKC活性的影响胞质：LPS刺激后细胞胞质PKC的活性升高，与正常组相比P0.05. 经PD治疗后PK

12、C活性有下降，与LPS刺激组相比P0.05，而治疗对照组PKC活性没有恢复. 胞膜：SMC胞膜PKC的活性也上升，与正常组相比P0.05. 经PD治疗后PKC的活性有所下降，与LPS刺激组相比P0.05. 不同的是治疗对照组的PKC活性下降更明显，与治疗组和正常组相比P值均0.01(表1).表1虎杖苷(PD)对烧伤血清及脂多糖（LPS）刺激下大鼠平滑肌细胞(SMC)蛋白激酶C活性的影响3讨论本实验中，烧伤血清刺激VSMC 2 h后, 胞质的PKC活性下降，胞膜PKC的活性上升，表明烧伤血清的作用主要是促进PKC的激活转位. 而PD处理则减低了胞膜PKC的活性，升高了胞质中PKC活性. 表明PD

13、可对抗烧伤血清引起的PKC异常变化. 实验中我们还发现治疗对照组的胞质PKC活性升高很多. 其原因可能为，治疗对照组是在烧伤血清的基础上加DHanks液，并没有去除烧伤血清，使烧伤血清的刺激作用长期存在，导致大量脂质氧化物质的产生，这些物质可以显著减慢DAG的降解2,5，从而持续不断的激活PKC，使胞质中PKC的活性持续升高，提示PD对烧伤治疗的机制可能与其调节PKC的活性有关. 它通过维持PKC活性的稳定来减轻机体的损伤.在感染性休克发生过程中，LPS是主要的致病因素. 从本实验结果来看，LPS刺激VSMC后，细胞胞质和胞膜的PKC活性均升高，表明LPS引起的损伤效应至少有部分是通过PKC信

14、号系统介导的. 其激活PKC的机制可能有以下几方面6：LPS能直接引起肌醇磷脂分解产生DAG，从而激活PKC；同时LPS与十四佛波乙酸酯相似，有可能以佛波酯类物质的方式直接激活PKC；此外，它还可以使机体释放大量血管紧张素、儿茶酚胺等因子，这些因子也能引起细胞膜肌醇磷脂分解产生DAG，进一步激活PKC.LPS损伤的VSMC给予0.4 mmol/L PD作用后，细胞质和细胞膜PKC的活性均减低. 提示PD可能是通过影响PKC的活性来对抗LPS的损害作用，但是PD是通过什么机制调节PKC的活性还不太清楚. 对于治疗对照组，其胞质的PKC活性与LPS组相比没有太大变化，而胞膜的PKC活性降低较显著，

15、这可能是由于PKC的耗竭机制和自我反馈机制而导致. 由于LPS的刺激在对照组并没有去除，其持续刺激一方面导致PKC的大量消耗，到后期没有足够的PKC从胞质转位到胞膜上，另外一个方面可能是由于PKC活性的升高反馈性的抑制了胞膜PKC的活性，从而降低了胞膜PKC的活性5.但是与烧伤损伤不同的是，LPS激活后的PKC并没有使平滑肌的收缩性增强，反而使其收缩性下降5. 这可能是由于LPS激活的PKC同工酶与其它损伤所激活的同工酶不同，进而导致其作用底物不同而致. PKC的同工酶不少于12种，其中cPKC包括PKC,和，而nPKC则包括PKC，和. 在LPS刺激SMC时，主要是PKC，和被激活. PKC

16、的磷酸化使诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活化，iNOS的增加导致了NO的大量合成，NO为强烈的舒血管因子，可以使血管强烈扩张. 由于LPS持续的刺激，PKC被持续激活，iNOS也就大量产生，使NO在胞内的含量增加，从而导致了SMC收缩性的下降.【参考文献】1 黄巧冰，赵克森，黄绪亮. 虎杖4号与多巴胺、6542治疗大鼠失血性休克疗效的比较J. 微循环学杂志， 1995, (1): 7-9.2 Begum N, Duddy N, Sandu O, et al. Regulation of myosinbound protein phosphatase by insulin in vascular

17、 smooth muscle cells: eva luation of the role of rho kinase and phosphatidylinositol3kinasedependent signaling pathwaysJ. Mol Endocrinol, 2000, 14(9):1365-1376.3 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术M. 北京:北京出版社, 1995: 131.4 Pease DC, Paule WJ. Electron microscopy of elastic arteries; the thoracic aorta of the ratJ. J Ultrastruct Res, 1960, 3: 469-483.5 Ha H, Yu MR, Choi YJ, et al. Activation of protein kinase cdelat and cepsilon by oxidative stress