对从中国四川泡菜中分离的乳酸菌进行识别和鉴定

1、对从中国四川泡菜中分离的乳酸菌进行识别和鉴定泡菜是传统的发酵蔬菜产品 , 在中国的四川省很受欢迎。本文研究的目的是通过分析来自四川省6 个不同地区的 36 个样品来调查主要物质乳酸菌在泡菜中的多样性（ 实验室 ） 。这些样品的实验室计数的记录是从3.90到8.40cfuml-1 。使用MRSO旨培养基，从这些样本中获得总共有185个假定的革兰氏阳性实验室和过氧化氢酶缺乏的属性，这些菌株被发现在物种水平生理测试上，16srRNA基因测序和PCRT增鉴定。结果显示,所有的所分离的乳酸菌都准确地确定为肠球菌thailandicus（2 株）、乳杆菌（16株）,1.短（24株）,1.paracasei

2、（9株）,1. 杆菌（81 株）,1.pentosus（38 株）,1.sakei（8株）,1.spicheri（1株）、乳酸明串珠菌（1 株） 和片球菌属 ethano1idu-rans（5 株） 。 四川泡菜的主要实验室 1. 杆菌， 它是从大多数样本中分离的。结果还表明 , 来自四川省不同地区的实验室物种复杂成分, 和这样一个资源丰富的实验室菌株为进一步的研究提供原始数据涉及益生菌菌株的选择。关键词：识别 ; 乳酸菌 ; 泡菜 ;16srRNA 基因序列介绍：泡菜 , 一种有点咸有点酸的发酵的蔬菜, 四川人已经吃了数百年。 由于制作简单和独特的风味, 泡菜很受欢迎，经常作为四川主菜的配菜

3、或者开胃菜。自制的泡菜都是基于高度依赖于原材料生存的微生物存在而自然发酵 , 。对于所需酸度和风味水平的不同 , 泡菜的制备过程是很重要的。通常许多蔬菜, 如白菜、芹菜、辣椒和萝卜都是沉浸在6-8%的盐溶液而红辣椒，葱和大蒜在一个特殊的罐子里夏天至少5-7天（约20-27° C）冬天长达 12-16 天（约° C）8-15 日。采收的蔬菜表面上有各种各样的微生物， 虽然蔬菜表面乳酸菌的数量（ 实验室 ） 通常是相对比较低的， 在最后的发酵阶段，由于实验室厌氧和低盐的条件使其快速增长（Haneta1.,2007） 。刚采摘的蔬菜表面所附着的微生物主要是革兰氏阴性腐生菌（Seo

4、eta1.,2010） 。在自然发酵过程的初始阶段，实验室的数量是低的，使得硝酸盐还原细菌快速增长（Yaneta1.,2008）。 在中间阶段, 肠杆菌科 （ 大肠杆菌、 肠杆菌属等） 和芽孢杆菌是低盐和厌氧条件下，他们逐渐死亡。同时, 实验室菌种快速增殖, 产生酸 , 在厌氧条件下成为优势种和抑制肠杆菌科和芽孢杆菌的生长。发酵结束时, 大量的实验室将会控制微生物，使泡菜发酵保持稳定（Karasueta1.,2010;PanagouandKatsaboxakis,2006） 。 因此， 它是值得实验室从泡菜中进行分离菌体使泡菜 能都进行工业化生产。这项研究报告是对来自中国四川省不同地区的 36

5、 个样品品种进行分离和鉴定。 185 个菌株通过表型特征进行初步鉴定，并且进一步通过16sRNA测序和PCRT增技术进行测定。材料和方法泡菜样品的收集， 36 个样本的泡菜收集来自四川省的六个不同的地区，泡菜在抽样时的温度范围从8.7 ° C到16.4。C;平均温度为13.2。C（表1）,在采样现场泡菜汁的pH值测定应用校准便携式酸碱计（美国ExtechpH100）， 室温下， 泡菜汁的样品收集时间为 15分钟 , 在冰上进行2-5h 运输和样品到达实验室后立即进行了微生物分析。计数和隔离的实验室稀释是 1 毫升的泡菜汁加9 毫升生理盐水（0.9%氯化钠 ） 。进一步连续稀释 10倍

6、，范围是10-5 到 10-9 ，在实验室进行处理和测定，使用布朗甲酚紫（BCP琼脂、Nissui制药、To-kyo、日本）厌氧30° C孵化2天，平板在30° C用灭菌锅罐进行灭菌，（巴尔的摩生物实验室，GasPak100厌氧系统，BD生物科学，火花，医学博士，美国）。菌落是从MR流养基上随机地挑取，每个平板含有30-300个菌落，（ManRogosaSharpe液体培养基，丙烯酰胺)，并转移到 5ml的MRS夜体培养基中，选中平板上的菌落在MR流养基上进行反复纯化，革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶是从纯化的平板中提取，在-80。C, 10%(w/v)脱脂牛奶进行冷冻储存。冻干

7、隔离进行长时间存储。实验室常规鉴别，进一步鉴定革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶，是由使用以下物理方法进行分离从精氨酸氨生产；二氧化碳是从倒杜伦管中的含有葡萄糖的MRS夜体培养基中提取，Tablel. GeneralfeaturesofpicklesamplesfromsixdifferentregionofSichuan.SiEng TeipHvalueMa-locationumbern(° C)(logcfuml -1)0.3 5.541.491to3Chengdu(15.5?16.4) (3.5?4.0) (4.15?7.11)summerradish13.1 &#

8、177;0.53.4 ±0.2 6.95 ±0.714to7Chongzhou(12.6?13.5) (3.2?3.5) (5.99?7.69)celery,cowpea,cabbage,bambooshoots12.3 ±1.73.7 ±0.4 6.65 ± 1.34summerradish,celery,cowpea,cabbage,Ch inese8to19Dayi(8.7?15.1)(3.5?4.5) (3.90?8.17)cabbage14.5 ±1.53.8 ±0.6 6.82 ± 1.51summer

9、radish,celery,cowpea,cabbage,ba mboo20to25Pujiang(11.5?15.3) (3.2?4.5) (4.89?8.26)shoots13.2 ±1.33.5 ±0.4 6.26 ± 1.09summerradish,celery,cowpea,Chinesecab bage,26to34Qionglai(11.9?15.3) (3.0?4.2) (4.36?7.54)carrot11.6 ±0.83.7 ±0.9 7.73 ±0.95summerradish,cowpea,celery,ca

10、bbage,ca psicum35to36Xinjin(11.0?12.2) (3.0?4.3) (7.05?8.40)frutescensAverage13.2 ±1.73.6 ±0.4 6.58 ±1.25分别在10° C,15° C,45° C和50° C的情况下在 MRS夜体培养基中生长 5天,在pH值为3.035,4.0,4.5,5.0,9.0和9.6的情况下在MRS夜体培养基中生长 3天，MR沸养基中的耐盐度为含有2.0%3.0%,4.0%,6.0%,6.5%,8.0% 和 10.0%氯化钠(w/v) ，在分离菌

11、种的温度下培养3 天(Ko-zakietal.,1992;Yuetal.,2011)。用一套商业工具通过D和L乳酸产生葡萄糖同分异构体的类型和数量来改变MR沸养基。(霍夫曼罗氏诊断，Mann-heim,德国)。碳水化合物发酵试验由根据Jayne-Williams 描述的方法(1975) 。 26 种碳水化合物通过使用糖基与氯酚红汤作为指标进行了测试。不同糖被添加到基础培养基用来改变培养基, 以最终浓度为 0.5%(w/v) 。碳水化合物发酵的结果检查是根据Bergey 系统细菌学手册 (KandlerWeiss,1986) 中所提供的信息。16srRNA基因测序和亲缘关系分析，总基因组的DN端

12、从5ML整夜培养的培养基中提取，温度设定为37。C,通过先前的方法(Yuetal.,2009)。纯化DN蹴度稀释到最后的100ng/以用来测定。16srRNA基因放大使用引物(GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)and16S-RA(AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTA)由sun进行描述等等(2010)核甘酸1至21是16S-FAand16S-RA特定的测序引物，分别地，16srRNA的基因实验室在自动热循环被放大(ptc-200;MJ 研究，沃尔瑟姆，美国)每个样本包含1 XTaq缓冲区(Ta-KaRaBio-C

13、o。、志贺、日本)、1.5毫米MgCl20.2科M每个核甘酸，10pmol每个引物,10ng细菌的DNA莫板和1.0U前任TaqTM聚合酶(豆类Bio-Co)。反应条件如下:5分钟94° C,94° C1分钟,1分钟58° C,72 °Cetalal.,2007), 一个序列比对和 phyloge-netic 树创建基于neighbor-joining(NJ) 方法。l.杆菌组的辨别，为进一步班别菌株l.杆菌组，进行多重PCRM定recA基于基因的引物：paraF(5 '-GTCACAGGCATTACGAAAAC-pentF(5 ' -C

14、AGTGGCGCGGTTGATATC)-planF(5 '-CCGTTTATGCGGAACACCTa,3和上一页(5 ' -TCGGGATTACCAAACATCAC-3 PCRmix-ture 和 amplifi 阳离子进行所述 Torrianietal 。 (2001) 。结果计数和分离的实验室泡菜样品的pH值范围从3.2到4.5(表1)。实验室的可行样品的数量都显示在表1。实验室36种泡菜样品在BCP琼脂培养基不同 cfuml-1范围从3.90到8.40。从成都，Chongzhou,大邑，浦江,Qionglaia 新津县地区实验室计数分别为 5.54 ± 1.49

15、,6.95 ± 0.71,6.65 ± 1.34,6.82 ± 1.51,6.26 ± 1.09,1.09 ± 7.73 日志 cfuml-1,分别。革兰氏阳性和过氧化氢阴性细菌生长的MR丽培养基被认为是假定的实验室，和185个假定实验室分离出 36 泡菜样品。Vol.58YUetal.Table2.PhenotypiccharacteristicofLABisolatedfromnaturalfermentedpickleinSichuanProvinc e,China.CharacteristicsaGroups123456789Numbe

16、rofisolates1624911981125ShapeRRRRRRCCCGasfromglucose-+-+-Lacticacidisomer bLDLLDLDLDLDLDLNHfromarginine-+-+-+-GrowthatpHvalue30c000000003.50068900003415249119411054.516249119511055.016249119511259.0009110511209.6000001020GrowthinNaCl(w/v)2.0%16249119511253.0%16249119511254.0%16249119511216.0%1610911

17、9511206.5%1007119510208.0%300895000010.0%000020000Growthattemperature(C)10142491190100115162491195112545003925012550000000000AcidfromD-Arabinose16240050000L-Arabinose162404350000D-Cellobiose160911950125Esculin1612911950125Galactose1624911950125Gluconate1624911950020D-Lactose022811950024D-Mannitol008

18、11900020D-Mannose160911950125D-Melezitose00811300000D-Melibiose024011950100D-Raffinose021011900100L-Rhamnose0001300004Ribose1624911951120Salicin160911950125D-Sorbitol00911950000L-Sorbose009000000D-Sucrose1614911950125D-Trehalose160911950005D-Xylose02403801100AllstrainsfermentedD-glucose,D-fructosean

19、dD-maltose.Nostrainsfermentedinulin,starch,xylitol orglycogen.aGroups1to9wereidentifiedas Lactobacillusalimentarius , L.brevis , L.paracasei , L.plantarum , L.sake i , L.spicheri , Leuconos-toclactis , Enterococcusthailandicus ,and Pediococcusethanolidurans ,respect ively. L:L-lacticacid,DL:DL-lacti

20、cacid,D:D-lacticacid.cNumberofpositivestrains.传统鉴定实验室根据形态、生理和生化特性，185株被分成9组（表2）。所有分离的菌种在 pH值5.0,15 °C20%,3.0%氯化钠进行生长，是 15° C而不是50° C或pH值3.0,使他们能发酵葡萄糖、 果糖和D-麦芽糖但不是菊粉，淀粉、木糖醇或糖原。十六个隔离组1被确定为l.硝化菌基于 生理生化特性（路透社 ,1983） 。 他们生产 L- 乳酸 , 但不能从葡萄糖或氨精氨酸产生二氧化碳。大多数分离菌种生长良好,10 ° C,pH值4.0和4.5,6.0%

21、和6.5%生理盐水，但只有3株可以生长在8.0%氯化钠。这些菌株可以利用D型和L型阿拉伯糖、核糖、半乳糖，甘露糖、七叶灵，水杨苷 , 纤维二糖 ,D 蔗糖 ,D- 海藻糖和葡萄糖酸。组 2 包括 24 杆状隔离 ,D 乳酸产生 ,并可能 产生二氧化碳从葡萄糖和NH3精氨酸。菌株可以增长10° C,pH值4.0和4.5,4.0%的氯化钠。除了 10隔离未能增长6.0-10%氯化钠。大多数分离菌株可以发酵 D型和L型、核糖D-木糖， 半乳糖，七叶灵,D乳糖,D蜜二糖，D蔗糖D-raffi糖，葡萄糖酸。这些菌株1.由于其短小的 特征。菌株3 组达到产酸但不能产生二氧化碳和氨, 生长良好 ,

22、pH 值3.5,4.0,4.5,9.0,4.0%,6.0% 和6.5%氯化钠，在10° C。这些分离株能产生酸的糖除了 D蜜糖 D-乳酸，L-乳酸L-鼠李糖,D-raffi 糖和D-木糖。考虑到所有的因素，这组被确定为 l.干酪 乳杆菌组。一百一十九组隔离 4被发现与l.植物乳杆菌密切相关。他们生产 DL乳酸但不能 从葡萄糖或氨精氨酸产生二氧化碳。多数能生长在3.5 ° C和45° C, ph为4.5、4、和6%10、 6.5%和 8%的氯化钠中，。所有菌株可利用阿拉伯糖，阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-甘露糖、D-山梨醇、纤维二糖、D-乳糖、D-密二糖，、海藻糖、葡

23、萄糖酸产酸产气。一株属于6组归类为L.spicheri基于自身的特性（ merothetal. ， 2004 ），其中包括生产乳酸，气由精氨酸而不是葡萄糖，这种菌株可以在10° C， pH 值 4 ， 4.5 ， 9 和 9.6 ，和 4%， 6%和 6.5%的 NaCl 增长，但仅能发酵核糖、木糖。 7 组的菌株属于属 leuconosTOC ，产生乳酸和发酵葡萄糖产生气体，但不水解精氨酸。该菌株能生长在温度45 度，pH4， 4.5 和 9， 4%和 6%的 NaCl ，利用核糖、木糖、半乳糖、D甘露糖、 秦皮甲素、 水杨酸、 纤维二糖、 D- 密二糖、 蔗糖和 d-raffi

24、鼻子。 双球菌组8， iDEN蒂菲为肠球菌属，产生乳酸而不能从葡萄糖产气。他们可以生长在45。C, PH值为4.5 , 9和 9.6 ，在4%， 6%和 6.5%氯化钠。这些菌株能够利用半乳甘露糖、核糖、东星、秦皮甲素、水杨素、甘露醇、d-cello-biose , D-乳糖，蔗糖和葡萄糖。五球菌9组确定为戊糖片球菌属基于糖发酵试验。 他们生产的乳酸， 但不能产生气体从葡萄糖或精氨酸。 大多数菌株生长良好，在45° C和pH值为3.5、4和4.5 ,只有一株可以在 4%勺NaCl在10的增长。他们可 以利用半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、秦皮甲素、水杨酸、纤维二糖、D-乳糖、蔗糖和海藻糖

25、。 16SrRNA基因测序和系统发育分析确认的物种，对所有菌株的16S/）。得到的序列（约 1400bp）沉积在GenBank登录号分别为：分以下gu125423, gu125424,和gu125427?谷125609。系统进化树分析显示的16SrRNA基因序列之间的关系代表菌株及相关型菌株利用MEGA：件（图1）。1组应变imau80014是L.阿里 mentariusDSM20249t密切相关（m58804）具有99.7%的同源性 20249tL.法典DSM（m58804）。应变 imau80001 组 2 和型菌株 ATCC14869tL.brevis （gu125423）聚为一个相 似

26、的99.8%组。3组应变imau80040放在副干酪乳杆菌 JCM8130t集群（d79212）具有100%的相似性。代表菌株imau80002 和 4 组出现一样都与植物乳杆菌ATCC14917tL.imau80005（aj965482 ）和L.戊糖乳杆菌JCM1558t （d79211）,和16SrRNA基因序列分析表明有99.9%的相似性属植物乳杆菌ATCC14917（t aj965482 ） 和 99.8%L. 戊糖乳杆菌JCM1558（t d79211） 。5 组应变 imau80073 是 L.sakeiDSM20017t 密切相关（am371184） 和他们共享99.8%的同源性

27、。6 组应变 imau80039 是 L.spicheriLTH5753t 密切相关（ aj534844 ） 100%引导分析。7组和 8组分 imau80024Leu 应变 imau80137 。链球菌和肠球菌（ JCM6123tab023968） thailandicusKCTC13134t （ef197994 ），和 16SrRNA基因序列显示100%的相似性型菌株。9 组应变 imau80011 接近片球菌ethanoliduransLMG23354t（ay956789）和他们共享 100%勺同源性。基于16SrRNA基因序列分析，177杆分离泡菜准确地分配给5种1组，即L.brevi

28、s （24株）、副干酪乳杆菌（ 9 株）， L. 法典（ 16株）， L.sakei （8株）， L.spicheri （1 株）和植物乳杆菌组（ 119 株），这些结果是一致的表型特征的结果。此外， 8 球菌均为大肠thailandicus（ 2 株）， P.ethanolidurans （ 5 株），和亮氨酸。链球菌（ 1 株）；然而，这些菌株均难以确定的物种水平的表型特征。 多重聚合酶链反应结果多重聚合酶链反应是用来区分密切的植物乳杆菌组相关的物种。对扩增产物的大小分别为 318bp 的预期为植物乳杆菌， 218bp 和 107bp的L.L.戊糖乳杆菌paraplantarum 。 81

29、株集团3型菌株植物乳杆菌 ATCC14917t产生318bp的产品，而38株和型菌株L.戊糖乳杆菌JCM1558t产生218bp的产品（图2）讨论泡菜是使用传统的和古老的自然发酵法。 这种独特的方法可以有效地保留有益微生物， 传统微生物对泡菜生产的一个主要的角色， 特别是独特的风味和FL 的益生特性。 在这项研究中，我们确定了组成实验室和描述的表型和基因型四川泡菜中的特性。 从不同地区的泡菜样品中观察到的实验室中的可行计数的轻微变化四川省。 泡菜平均数来自崇州、 大邑、 蒲江和邛崃的样品低于新津的样品，略高于成都的样品，和四川泡菜汁实验室平均值6.58 ±7 .25CFUmL-1 的

30、日志。因为原料和泡菜温度在六个地区不同（表1），所以我们认为实验室的这种差异计数可能与蔬菜的种类有关， 泡菜的来源和温度。 一百八十个网络实验室被隔离泡菜样品， 所有菌株分为9 根据生理特性，营养需求和生长的常规方法组条件。然而，基因型分析表明所有这些菌株被确定为 10 种。根据生理特性，在 7 组， 8 株 9 是确定属于肠球菌属（2株），属明串珠菌（1株）和属片球菌（5株），和16SrRNA基因序列分析表明，代表菌株形成一个良好定义的集群类型株在系统进化树。此外， 4 组菌株确定为属于植物乳杆菌组（119菌株）的表型特征的基础上，他们16SrRNA基因序列显示99.8%的相似性植物乳杆菌、

31、戊糖乳杆菌L. 。 ennahar 等人。（2003）报道称，植物乳杆菌和L. 戊糖乳杆菌有很类似的16SrRNA基因序列相差只有 2英国石油。在本研究中，应用多重聚合酶链反应技术对这 2 种植物进行了鉴别显示81 株从 4组确定为 L. 植物乳杆菌、戊糖乳杆菌， 38 株 L. 。传统的表型特征往往会产生变量为密切相关的实验室鉴定结果（柳田稔etal. ， 2007）；因此表型特征和分子生物学技术相结合， 准确地在物种水平鉴定实验室。 不同样本间的分离分布在表 3 。的主要菌株。植物乳杆菌（43.8%）是从所有采样分离网站和大多数样品，和L.戊糖乳杆菌（20.5%），L. 群（13%）和L（ 8.6%）是从法典的采样点分离。其他物种隔离与相对较低的频率，包括副干酪乳杆菌， L.sakei ， L.spicheri ，P.ethanoliduransthailandicus ， E. ， 亮氨酸。 链球菌。 短乳杆菌和植物乳杆菌，