低聚异麦芽糖改性及抑菌作用初探

1、低聚异麦芽糖改性及抑菌作用初探车晓彬 冯莉 谢长丽（山东鲁抗医药股份有限公司，济宁，272021）摘要：本文利用低聚异麦芽糖抑菌试验证明，除青霉外，对其它菌无效果，通过对低聚异麦芽糖进行改性研究，其抑菌证明，改性的1%低聚异麦芽糖溶液，使病原真菌无法生长，抑菌率达100%，而灰霉的抑菌效果>50%。关键词：低聚异麦芽糖 改性 抑菌1、概述低聚异麦芽糖(Isomaltaligosaccharides)是指葡萄糖之间至少有一个以上以（16）糖苷键结合而成的单糖数在2-10不等的一类低聚糖，又称分枝低聚糖。其结构为：低聚异麦芽糖有一定的甜度，约为蔗糖的50%，且甜味柔和醇美，可以用来替代部分蔗

2、糖食品的甜度，改善其味质；它的黏度与相同浓度蔗糖溶液很接近，食品加工易操作，对于糖果、糕点等的组织与物性无不良影响；它耐热、耐酸性极佳，浓度50%糖浆在pH=3、120下长时间加热不会分解，应用到饮料、罐头及高温处理或低pH食品，可以保持其功能与特性；低聚异麦芽糖保持水分不易蒸发，对各种食品的湿润与维持其品质效果好，并能抑制蔗糖的结晶形成，这对面包类、甜点心等以淀粉为主体的食品，稍加存放即行硬化者，添加低聚异麦芽糖浆因能防止淀粉老化而延长食品的保存时间；它的水性活度Aw=0.75,比蔗糖（0.85）、高麦芽糖浆（0.85）、葡萄糖浆（0.77）的都低，而一般的细菌、酵母、霉菌在Aw<0.

3、8的环境中均不能生长，这意味着低聚异麦芽糖具有较佳的防腐效果，具有一定的抑菌作用。由于低聚异麦芽糖所含糖分子末端为还原基团，与蛋白质或氨基酸共热会发生美拉德反应而产生褐变着色，着色程度的深浅与糖浓度有关，并与共热的蛋白质或氨基酸的种类、pH值、加热温度及时间长短有关，所以，采用低聚异麦芽糖加工各种食品时，应考虑到上述各种因素的配合。它具有难发酵性，所以很难为酵母及乳酸菌利用，因而添加到发酵食品中不会被破坏，仍然可发挥作用。低聚异麦芽糖有较强的抗龋齿性，是因为它不为链球菌作用，若与蔗糖混用能强烈抑制由蔗糖生成葡聚糖，而起到保护牙齿的作用。日本的光冈知足等人研究证实：低聚异麦芽糖是良好的双歧杆菌增

4、殖因子，每天服用一定数量的低聚异麦芽糖，例如15-20g，能促进肠内双歧杆菌大量繁殖，抑制有害菌的生长，从根本上增强了人体的免疫力。鉴于低聚异麦芽糖的上述功能特性，该糖是一种新型的优良的食品添加剂，可广泛应用于饮料、乳制品、糖果、糕点、果酱、蜂蜜以及营养口服液等各种食品。由于数量太少，它的功能性不能明显表现出来，所以，人们多年来追求大量地生产这种低聚糖。随着微生物酶工程深入研究的发展，大工业生产这种低聚糖才成为可能。低聚异麦芽糖于1982年由日本林原生化研究所开发成功，1985年，由昭和产业公司首先推入市场。目前，日本有多家公司生产这种低聚糖，年产量超过10000吨。一直以来，日本在这方面的研

5、究、开发与应用位居世界前列，而美国、德国目前极少报道。在我国，对低聚异麦芽糖的研究才刚刚起步，因此有大量的工作要做。我国是农业大国，淀粉原料极为丰富，用玉米、大米、甘薯等均可作为原料，采用酶工程技术生产新型低聚糖。因此，低聚异麦芽糖在我国具有十分广阔的前景，它的研究生产必将促进我国保健食品的发展，并可望在其它领域有进一步的研究、开发。目前，低聚异麦芽糖主要用于食品工业，其它领域尚未报道。对于低聚异麦芽糖，一般的细菌、酵母、霉菌都不能利用，况且，它又具有良好的成膜性、高保湿性和无毒副作用，如果能够利用到果品、蔬菜、鲜花等保鲜上，它将成为一种新型的绿色保鲜剂。大量资料上报道甲壳低聚糖可以用于水果保

6、鲜，效果较好。但是，甲壳低聚糖的制备工艺复杂，成本较高，而低聚异麦芽糖的生产工艺较简单，成本低。为此，低聚异麦芽糖用于果品、蔬菜、鲜花等保鲜上，如获得成功，将会带来不可估量的经济效益。因此，我们进行了低聚异麦芽糖改性及抑菌实验研究。2、低聚异麦芽糖抑菌作用2.1实验材料及方法材料（1）常用病原菌：青霉（peni）、西瓜枯萎菌（Fon）、苹果炭疽菌（c.gly）、聚端孢、茄子菌（v.dal）、番茄叶霉菌（Ful）、立枯丝核（Rhizo）、灰霉（Botory）（2）培养基：PDA（3）仪器：LS-B35L型 立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备厂）、DH5000型电热恒温培养箱（天津泰斯仪器有限公

7、司）、无菌台方法：（1）带菌滤纸片制备：取培养5天上述病原菌斜面，注入5ml无菌水，冲洗孢子液，倒入灭菌后的空培养皿中，取灭过菌的滤纸片，浸泡在孢子液2min，备用。（2）低聚异麦芽糖抑菌作用 不同的培养基制备： A: 水 + 2%琼脂 B: 水 + 2%琼脂 + 2%葡萄糖 C: 水 + 2%琼脂 + 2%低聚异麦芽糖将上述制备的A、B、C培养基灭菌，倒平皿。将（1）中的灭菌滤纸片放入皿中央，28下培养，96小时后测定菌落大小。每实验重复三次。（3）低聚异麦芽糖膜对病原菌的作用 a:取灭菌过的10%、20%、30%、40%、50%低聚异麦芽糖溶液1ml，涂布于PDA平皿培养基上，接入含菌的滤

8、纸片，28培养，96小时后测定菌落大小并记录生长情况。 b:同a一样，将涂布低聚异麦芽糖溶液于培养皿中，置于30恒温培养箱，鼓风干燥。两天后，使其表面水分蒸发形成一层低聚异麦芽糖膜，再接含菌滤纸片，28培养，96小时后测定菌落大小并记录生长情况。2.2结果及分析：低聚异麦芽糖抑菌作用表1： 低聚异麦芽糖抑菌作用 培养基病原菌ABC立枯丝核极少量菌丝1.1菌丝较少苹果炭疽菌3.23.42.4番茄叶霉菌1.82.22.1西瓜枯萎菌3.34.03.7聚端孢1.31.41.2茄子菌1.01.21.1青霉2.83.22.7灰霉0.72.31.5由表1可以看出：各病原菌在含2%葡萄糖的培养基上生长最快，其

9、营养利用率较高，菌落直径略大，在含2%低聚异麦芽糖的培养基上生长情况与不含碳源的培养基基本相当，且观察过程中发现，培养相同时间时，含2%低聚异麦芽糖培养基上菌丝普遍稀疏，不饱满，孢子成熟晚，其正常生命周期明显推迟。因此，可看出：低聚异麦芽糖可作为真菌碳源而被利用，但利用率极低，这是由于该三碳以上的低聚异麦芽糖纯度为90%，它不易被微生物利用，其中10%的低聚异麦芽二糖可被某些微生物利用。低聚异麦芽糖膜对病原菌的作用 由a实验以湿平皿接种，培养96h后观察，发现各处理与CK生长情况基本相当，无明显区别。这说明低聚异麦芽糖溶液在培养基表面并没有起到抑制真菌生长的作用，这是由于其溶液具有流动性，不能

10、阻断病原菌对PDA培养基中营养吸收。由b实验，培养96h后，其菌落直径见表2。表2： 低聚异麦芽糖膜对病原菌的作用 培养基病原菌CK10%20%30%40%50%青霉5.44.84.0无无无茄子菌1.81.61.11.21.21.3苹果炭疽菌4.14.03.84.03.94.0番茄叶霉菌1.81.61.71.71.61.7聚端孢2.82.22.42.52.32.1立枯丝核8.05.65.26.57.06.9西瓜枯萎菌4.94.64.44.44.54.6灰霉4.24.03.83.83.93.7由表2可知：青霉菌在30%以上浓度的低聚异麦芽糖膜表面不生长，而在10%和20%有较弱生长，其余各菌在各

11、处理平皿中均有生长，但菌落直径均小于CK且观察发现其菌丝生长稀疏。这是由于低聚异麦芽糖溶液在自由水挥发后能形成一种透明的网孔状膜，既起到一种机械屏障的作用，又防止病原菌与营养物接触，浓度越高其网孔小致密大。故青霉菌在30%浓度以上不生长，而对于灰霉等较强病原菌可以通过网孔而插入吸收营养，使屏障作用减弱。2.3讨论由以上实验可得结论：1、 低聚异麦芽糖可作为真菌的碳源而被利用，但利用率较低。2、 不同浓度低聚异麦芽糖溶液涂布PDA平皿时，若不使自由水挥发，无抑制作用，而烘干后，低聚异麦芽糖成膜，可起到一定的机械屏障作用，但效果不明显。 由于低聚异麦芽糖具有良好的成膜性和保水性，但其本身抑制病原菌

12、并不理想，鉴于此我们开展了对低聚异麦芽糖的改性，使其糖侧链带上活性基团，以期达到抑菌杀菌作用。3、低聚异麦芽糖的改性初探3.1材料与方法 材料：（1） 菌种及培养基：同。（2） 试剂：葡萄糖、乙醇、低聚异麦芽糖（甘肃）、氢氧化钠溶液（10mol/L）、改性剂（有机酸）、脱改性剂（醇类）（3） 仪器：FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、LS-B35L型 立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备厂）、DH5000型电热恒温培养箱（天津泰斯仪器有限公司）、循环水式真空泵、RE-52AA旋转蒸发器（上海嘉鹏科技有限公司）、无菌台、酸度计、磁力搅拌器。方法：(1)改性方法：称取5g低聚异麦

13、芽糖，溶于水乙醇溶液（1：1 v/v）中，加入10mol/LNaOH溶液10ml，常温（25）搅拌30min后，加入5g改性剂搅拌反应，每1h测定一次pH值，每间隔2h加入10mol/L的NaOH调节pH>8，每间隔2h加入5g改性剂，共20g，恒温搅拌反应8h，调至pH=78，50浓缩干燥，再用23倍体积的改性剂浸泡10min，过滤后于45的恒温箱中烘干得米黄色粉末成品。60改性方法同上。(2)改性低聚糖定性检测：采用红外光谱法测定改性后低聚异麦芽糖的活性官能团。(3)改性低聚异麦芽糖抑菌作用：将常温和60下改性物配成5%水溶液，灭菌待用。取病原菌孢子液0.3ml涂布于PDA平皿培养基

14、上，将牛津杯对称放置，分别加入0.2ml的两种改性溶液，28培养，观测其抑菌圈大小，CK为5%未改性低聚异麦芽糖溶液。各处理重复三次。(4)改性物中其它物质对菌体的作用：a:NaCl对菌体作用：配置10%改性物溶液（常温和60），10%低聚异麦芽糖溶液和8%NaCl溶液各30ml，分别取0.2ml加入牛津杯对照比较抑菌圈大小，实验方法同（3）。b:改性剂对菌体作用：配置1%改性剂溶液pH=7，5%的改性低聚异麦芽糖溶液，5%低聚异麦芽糖溶液各30ml，分别取0.2ml加入牛津杯对照比较抑菌圈大小，实验方法同（3）。(5)改性物成膜后对菌体的作用：将改性物分别配成1%、2%、3%的水溶液，灭菌后

15、，各取1ml涂布于PDA平皿培养基上，30鼓风干燥后，将带有菌体的滤纸片放于培养基中部，28培养72h后，测定菌落大小。3.2结果与分析改性低聚异麦芽糖的定性：从红外光谱图中可看出在1610-1550cm-1内出现“O” 的特征吸收带，在1419、1250、930 cm-1三处同时出现它的三条相当明显的吸收带，这已说明糖侧链发生取代反应，加上羧基。在1075 cm-1处出现“COC”的特征吸收带，红外光谱图显示对低聚异麦芽糖的改性基本实现，但具体取代反应除发生在C6外其它C上是否发生取代，则有待进一步研究。改性物抑菌作用：培养72h后，5%浓度的25改性物出现明显的抑菌圈，直径为1.5cm，而

16、60改性物和CK并无抑菌圈出现，这表明25改性后的低聚异麦芽糖由于带上了“COO-”而具有了较强的抑菌性能。初步认为25改性优于60改性，可能是由于高温下改性低聚异麦芽糖的糊化，失去了抑菌作用。改性物成膜后对病原菌的作用：见表3表3： 改性物成膜后对病原菌的作用 培养基病原菌CK1%2%3%青霉2.7无无无西瓜枯萎菌3.8无无无苹果炭疽菌1.9无无无聚端孢3.3无无无茄子菌少量菌丝无无无番茄叶霉菌1.8无无无灰霉4.22.01.81.5从表三中可以看出：其抑菌作用明显提高，改性物1%浓度足以完全抑制青霉、西瓜枯萎菌、苹果炭疽菌、聚端孢、茄子菌、番茄叶霉菌这几种菌的生长，而对于灰霉的抑制效果不如

17、其它菌，但抑菌率>50%。这表明由于活性基团的加入，而使其具有了明显的杀菌抑菌作用。改性物中其它物质对菌的作用：由于改性过程中，不能保证底物完全反应，反应后的改性物可能存在两种次生产物即改性剂和NaCl,为了排除改性剂对菌体作用，故用醇类洗脱剂，因为改性剂在醇中，具有很高的溶解度，而改性物却不溶。通过实验，证明8%NaCl和1%改性剂对病原菌不产生抑菌作用，故可排除两者影响。3.3讨论改性原理的讨论确切的改性物结构尚不清楚。红外光谱显示糖链上，发生“COO-”的取代反应，由于低聚异麦芽糖结构，具有游离的C6羟基，最易发生取代反应。其反应原理如下：低聚异麦芽糖-OH + NaOH 低聚异麦

18、芽糖-ONa + H2OCl-改性剂-COOH + NaOH Cl-改性剂-COONa + H2O低聚异麦芽糖-ONa + Cl-改性剂-COONa 低聚异麦芽糖-COONa + NaCl其可能的副反应：Cl-改性剂-COONa + NaOH Cl-改性剂-COONa + NaCl尚需进一步的研究论证。 改性低聚异麦芽糖杀菌作用机理讨论：由于改性低聚异麦芽糖具有很好的成膜性，它可在营养物表面形成一层薄膜，阻止病原菌吸取营养，起到一种天然屏障的作用；另外，由于改性后带上了“COO-”的负电荷，作用于病原菌膜里的正电荷，使膜透性加大，抑制或杀死膜内外物质渗透性变化，改变了细胞内正常的代谢活动抑制菌体生长。当然其作用机制仍需进一步实验研究论证。4、总结及展望 通过以上实验我们得出以下几点结论，并对今后的工作方向提出些许建议： 1、低聚异麦芽糖为难发酵性糖，不易被病原菌分解利用且其具有一定的成膜性，30%以上浓度成膜后可抑制青霉素生长。对其它病原菌无效果。 2、改性后的低聚异麦芽糖，其柔韧性、成膜性大大提高，并且具有了较强地抑菌性能，改性物1%浓度成膜后足以完全抑制青霉、西瓜枯萎菌、苹果炭疽菌、聚端孢、茄子菌、番茄叶霉菌等病原真菌的生长，而对于灰霉的抑制作用