酶联免疫吸附分析及其在食品安全检测中的应用

1、收稿日期:2003-11-07作者简介:邱伟芬(1965-,女,副教授,在读博士,研究方向为食品科学。酶联免疫吸附分析及其在食品安全检测中的应用邱伟芬(南京财经大学,江苏南京 210003摘 要:主要介绍了酶联免疫分析(E LISA测定的基本原理和分类,讨论了它在食品安全检测中的应用,如检测食品中毒素、病原微生物、农药残留、兽药残留、转基因食品成分等。关键词:酶联免疫分析;原理;食品安全检测;应用中图分类号:TS221 文献标识码:A 文章编号:1003-6202(200403-0044-02ELISA and Its Application in Food Sa fety Determ in

2、ationABSTRACT:The basic principle and classification of the enzyme linked i mmunosorbent assay (E LISAwas introduced.And the application of ELISA in food safety determination was discussed,including food toxins,pathogenic microorganis ms,pesticide residue,animal dru g residue,and the compositions of

3、 genetically modified foods,etc.KEY WORDS:ELISA;principle;food safety determination;application 酶联免疫吸附分析(enzyme-linked i mmunosorben t assay,简称ELISA 又称酶标法,是在免疫酶基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,已有30多年的历史1。目前,ELIS A 已广泛应用于临床医学、兽医学、生物学等领域,在食品领域中应用相对较少,但ELIS A 法特异性高、敏感性强,随着食品安全问题日益受到学术界和政府的关注,它在食品安全检测中的研究和应用越来越多。本文通

4、过对ELISA 方法及其应用的讨论,旨在促进该技术在食品安全检测领域的应用和推广。1 ELISA 测定原理和分类1.1 基本原理ELIS A 是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术,它既可测抗原,也可测抗体。ELIS A 用固相载体吸附抗体(抗原,加待测抗原(抗体,再与相应的酶标记抗体(抗原进行抗原抗体的特异免疫反应,生成抗体(抗原-待测抗原(抗体-酶标记抗体(抗原的复合物,最后再与该酶的底物发生反应生成有色产物。待测抗原(抗体的定量与有色产物量成正比,因此可借吸光度值计算抗原(抗体的量,ELISA 法既可进行定性测定,又可进行定量测定2。在上述反应中,酶促

5、反应只进行一次,而抗原-抗体的免疫反应可进行一次或数次。1.2 分类ELISA 方法的分类至今无统一的标准,常用的测定方法有三类: 间接法测抗体:将特异性抗原包被在固相载体上,形成固相抗原,加入待检样品(含相应抗体,其中抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物,再加入酶标记的抗抗体(又称二抗,与上述复合物结合,此时加入底物,复合物上的酶则催化底物而显色,由于每步之间均有冲洗步骤,因此,若样品中不含相应的抗体,酶标抗体则将被洗掉,底物不显色而呈阴性反应;若样品中含相应的抗体,底物显色而呈阳性反应。 双抗体夹心法测抗原:将已知的特异性抗体包被在固相载体上,形成固相抗体,加入待检样品(含相应抗原,其中抗原

6、与固相抗体结合成复合物,再加入特异性的酶标抗体,使之与已形成的抗原-抗体复合物结合,当加入底物时,酶则催化底物而显色,根据颜色的有无和深浅对待测抗原进行定性和定量分析。!竞争法测抗原:将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体,加入待测样品(含相应抗原和相应的一定量的酶标抗原,样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,待测样品中抗原含量越高,则与固相抗体结合的越多,使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少,甚至没有机会结合,这样加入底物后就不显色或显色很浅,显色深者为阴性2、3。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原,适用于临床诊断上,而竞争法是测定小分子抗原的方法,因而尤其适用于食品安全检测。由

7、于食品安全检测需测定的物质大都是低分子量的,但免疫动物产生抗体的抗原分子量要大(至少50000u,因此,首先必须使小分子物质结合上高分子蛋白质,才能作免疫之用。竞争法按实验操作步骤的不同又可分成直接竞争法和间接竞争法。研究者可根据自身的条件和实际要求,灵活地设计适当的E LISA 法。2 ELISA 法在食品安全检测中的应用2.1 食品中毒素的测定真菌毒素是其产生菌在适合产毒的条件下所产生的次生代谢产物。在食品加工时,虽然经加热、烹调等处理,但它们所产生的毒素一般不能被破坏,真菌毒素在食品卫生理化检验项目中占一定的比例,且日益受到人们的重视。黄曲霉毒素是一种致毒性和致癌性很强的真菌毒素,各国都

8、严格限制其在食品中的含量。它是一组化学结构类似的化合物,目前已分离鉴定出12种,一般食品中黄曲霉毒素含量以毒性最强的B 1计。1977年,La Well 首先采用了ELISA 法来检测黄曲霉毒素,利用小分子黄曲霉毒素B 1结合蛋白质免疫动物得到抗黄曲霉毒素B 1的免疫球蛋白(抗体,并合成了酶标黄曲霉毒素B 1结合物,建立了直接竞争ELISA 法检测黄曲霉毒素B 1。随后,美国学者朱繁生教授,英国学者Morge 教授分别改进了直接法并建立了间接竞争ELISA 法。我国食品卫生理化检验方法#的国家标准中,黄曲霉毒素的检测用间接竞争法。样品中的黄曲霉毒素B 1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应

9、,多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标二抗和底物后显色,与标准比较来测定含量,最低检出浓度可达0.01 g/kg,具体检测步骤可参照GB/T 5009.2219964。小麦及其制品中T-2毒素的测定可用间接竞争法和直接竞争法进行测定,最低检出量为1 g/kg,标准号为GB/T149331994。大麦中的褐曲霉毒素A(Ochratoxin也可用E LISA 法来测定。442004,No.3粮食与饲料工业2.2 食品中病原微生物的筛选病原微生物是食品生物性污染的重要因素。ELISA法可检测食品中沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌O-157等微生物。其中沙门氏菌是细菌性食物中毒中最常见的致病菌

10、,它严重影响着食品安全4。传统的沙门氏菌检测法试剂繁杂、检测周期长,远远不能适应实际需要,而E LISA试剂盒则能方便、快速地筛选出沙门氏菌污染的食品或饲料。用E LISA法来筛选沙门氏菌,采用的抗体既可以是单克隆抗体(M cAb,也可以是多克隆抗体。其基本步骤是首先包被抗沙门氏菌的单克隆抗体(多克隆抗体,然后在微孔板内加入经过前增菌和选择性增菌的待检样品,样品中如有沙门氏菌存在,则与微孔板内的特异性抗体结合形成复合物。洗涤掉多余的反应物,加入酶标二抗,则形成抗原抗体酶标二抗复合物。加入底物,测定光密度,当光密度值大于或等于临界值时,即可推断为阳性。对一些自然污染沙门氏菌和人为加入沙门氏菌(0

11、.040.2cfu/ml的食品用Salmonella-T ek 试剂盒进行检测,其结果与常规培养方法进行检测的结果进行比较,两者结果具有完全的一致性。Lyer M S和Cousin M A 等人研究了用间接E LISA法来测食品和饲料中镰刀菌的灵敏度和特异性,可检测出102103cfu/ml的含量5。2.3 食品中农药残留的测定农药残留是指农药使用后残存于食品(农副产品中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。目前,农残已成为我国人民膳食的主要食品安全问题,也是影响我国农产品出口的一个重要因素。常用的农药残留检测方法如薄层层析法(TLC和气相色谱法(GC已不适应目前的检测要求,而E L

12、ISA 在农药的检测方面已得到了初步应用和发展。农药属于小分子物质,是一种半抗原,无免疫原性。检测时首先要根据农药的结构选择合成路线,人工合成抗原,然后免疫B ALB/c小鼠,利用杂交瘤技术则可制备出针对农药小分子的McAb。由于McAb 可以大量产生,且McAb来自统一细胞,质地均匀,易于标准化管理,比较容易制备试剂盒6、7。可用ELIS A检测的农药残留种类包括: 有机磷农药: 1994年Ibrahi m等采用杂交瘤技术制备了对硫磷特异性McAb,用E LISA法检测对硫磷含量,其灵敏度和特异性可以和GC相媲美;Hill等用半抗原杀螟硫磷(FN与载体蛋白结合,制备了一系列兔多克隆抗体和小鼠

13、M cAb,用于ELIS A 法检测,结果发现M cAb的灵敏度比多克隆抗体高,检测限为23 g/L。拟除虫菊酯类农药:它常与有机磷农药混配使用,在食物中残留量较低,液相色谱等传统的检测方法对其不够特异、灵敏,Skerrit等用拟除虫菊酯类半抗原氯菊酯与载体蛋白BSA结合制备特异性M cAb,用三种免疫分析方法检测小麦和面粉中的氯菊酯,发现M cAb结合到微滴度板上效果最好,最低检出量为1.5 g/L。!有机氯类农药: Deschamps等用毒莠定与BSA结合免疫兔和小鼠,分别制备多克隆抗体和McAb,比较两者的灵敏度和特异性,兔抗血清的线性范围为55000ng/ml,最低检出限为5ng/ml

14、,小鼠McAb的线性范围为120ng/ml,最低检出限为1ng/ml。近年来有机氯农药免疫检测试剂盒较多810。2.4 动物食品兽药残留和违禁药物的测定主要兽药残留有抗生素类、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫类、激素药类和驱虫药类。饲料中使用瘦肉精,它导致肉品中有残留,严重影响动物食品安全。瘦肉精是盐酸克伦特罗(C L的俗名,是一种 肾上激素受体激动剂,人们食用了含瘦肉精的肉,会导致头痛、头晕、心悸、四肢麻木等一系列反应。对瘦肉精的分析国际上有色谱技术、免疫技术和生物传感技术等,目前ELISA法广泛应用于饲料中瘦肉精的初筛。国家质量监督检验检疫总局推荐英国Randox公司生产的ELISA试剂盒为我国

15、检测动物激素和抗生素残留的首选试剂。我国也研制出了同类试剂盒,经比较与国外产品具有可比性,该法常用于尿与组织样品中残留测定11。用ELISA法检出的阳性结果,需用其它方法证实,如GC/MC、LC/MS、GC/FTIR,通常用GC/MS确证。2.5 转基因食品的检测转基因食品的安全性是最近有关食品安全性研讨的热点。由于其安全性还在争议之中,许多国家都有严格的法规来管理转基因食品。其中有一条规定就是要求在转基因食品包装上贴上标签,让消费者有知情权。这就需要对转基因食品进行检测。检测方法有: PCR技术来直接检测转基因;ELISA法来间接检测转基因表达的目的蛋白质1214。FDA已研究了用双夹心EL

16、ISA法来检测食品是否含转基因玉米成分。EnviroLogix ELISA测试盒可用以测定玉米中的Cry9C蛋白,共测试了9种含玉米的食品,在同实验室和实验室间进行,结果的重现性相当好。3 结语食品安全检测的发展方向是快速、灵敏、简便。ELISA分析与其它方法相比,有以下优势: 高特异性;高灵敏性,检测范围在ng和pg水平;!准确度高、重现性好;%一次性可处理大量样品,适宜于用定性试验进行筛选;&易于推广到基层。E LISA分析也存在着一些缺陷,比如: 不能同时分析多种成分;对试剂的选择性高;!对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。但如果与其它检测手段联合使用,如GC、HPLC,既可

17、增加检测的灵敏度又可降低交叉反应,还可进行更准确的定量。随着McAb技术的成熟,随着新ELISA法的不断出现,随着免疫试剂盒的商业化,ELISA分析在食品安全检测领域中一定会得到进一步的应用和推广。参考文献1 杨利国,胡少昶,魏平华,等.酶免疫测定技术M.南京:南京大学出版社,1998.2 朱正美,刘 辉.简明免疫学技术M.北京:科学出版社,2002.3 梁国栋.最新分子生物学实验技术M.北京:科学出版社,2001.4 杨洁彬,王 晶,王柏琴,等.食品安全性M.北京:中国轻工业出版社,1999.5 Lyer M S,Cous in M A.Immunol ogical Detection of

18、 Fus arium Speci esin a Model Food SystemC.2002IFT Annual Meeting,USA,2002.6 Abad A,Primo J,M onotoya A.Development of an Enzyme linked Immunosorbent Assay to Carbaryl. 1.Antibody Production from Several Haptens and Characterization i n Di fferent Immunoas say FormatsJ.JAgric Food Chem,1997,45:14861494.7 Ibahim A M A,Mors y M A,HewediM M,et al.Monoclonal AntibodyBas ed ELISA for the Detecti on of Ethyl Parathion Immunoass ay DevelopmentJ.J Agric F