大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织谷氨酸转运体功能变化及地塞米松

1、    大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织谷氨酸转 运体功能变化及地塞米松的影响*        摘要目的：探讨大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织谷氨酸转运体功能及超氧化物岐化酶(SOD)活性、脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量变化及地塞米松对其的影响。方法：采用大鼠三血管夹闭、松夹制作大鼠完全性脑缺血-再灌注损伤的模型。测定假手术对照组、脑缺血-再灌注损伤(I-R)组和I-R+地塞米松组的皮层、海马、纹状体的谷氨酸转运体功能及SOD活性、MDA含量的变化。结果：脑缺血-再灌

2、注损伤时3个部位的谷氨酸转运体的功能均明显降低(P0.05，P0.01)、SOD活性显著降低(P0.05，P0.01)，MDA含量明显升高(P0.05，P0.01)，I-R+地塞米松组的3部位谷氨酸转运体功能与I-R组相比有明显恢复(P0.05，P0.01)，与对照组已无明显差异(P0.05)；SOD活性回升(P0.05，P0.01)、MDA含量回降(P均0.05)。结论：大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织三部位的谷氨酸转运体功能降低，且可能与自由基效应有关；而地塞米松则可能通过抗自由基效应使谷氨酸转运体功能恢复而发挥其抗损伤作用。主题词脑缺血；再灌注损伤；自由基；地塞米松；大鼠 Damage o

3、f glutamate transporter function during ischemia-reperfusioninjury of rat brain and antagonistical effect of dexamethasoneREN Xiao-Yan,QU Zhong-Sen,GE Bao-Lin,ZHANG Yu-Min,XU LuoQingdao University Medical College,Qingdao(266021)Abstract AIM:To investigate the changes of glutamate transporter functio

4、n,superoxide dismutase (SOD) activity and malondiadehyde (MDA) content in rats with injury of cerebral ischemia-reperfusion and antagonistical effect of dexamethasone.METHODS：A model of brain ischemia-reperfusion injury was established by clipped three arteries and then released to reperfuse blood i

5、nto brain in rats.The glutamate transporter functions,SOD activities and MDA contents in cerebral contex,hippocampus and striatum of control,I-R and dexamethasone groups were determined.RESULTS：Glutamate transporter function and SOD activity of above three sites in I-R group were decreased significa

6、ntly (P0.05，P0.01) and MDA contents were increased (P0.05，P0.01),compared with control group.The glutamate transporter function,SOD activity and MDA content in the above three sites of I-R+dexamethasone group were recovered,compared with I-R group.CONCLUSION：Oxygen free radicals,which were produced

7、in the ischemia-reperfusion injury might result in the inhibition of glutamate transporter.Dexamathasone may antagonize the injury effect of the oxygen free radicals by acting on glutamate transporter in membrane.MeSHCerebral ischemia;Reperfusion injury;Free radicals;Dexamethasone;Rats谷氨酸是脑内主要的兴奋性神经

8、递质之一，其在突触间隙积聚会引起神经元损伤。正常时谷氨酸不能在突触间隙中降解，而是被神经元突触前膜或神经胶质细胞的谷氨酸转运体所转运，从而终止其对突触后膜的兴奋性作用1。有关资料证实2：缺血性脑损伤中有氧自由基参与并与兴奋性氨基酸相互作用。也有资料认为地塞米松有抗自由基作用3。本文利用大鼠脑缺血-再灌注损伤模型探讨脑缺血-再灌注损伤时谷氨酸转运体功能及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化及地塞米松的对抗作用，并探讨脑缺血再-灌注损伤机制中谷氨酸转运体功能变化的作用及其与自由基的关系。材料与方

9、法一、实验材料：3H-L-谷氨酸(美国杜邦公司，152.07×1010 Bq/mmol)；SOD(河北保定市生化营养源开发中心，4 000 U/mg)；MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。高速冰冻离心机(日本Tomy公司出品，RS-20型)；液体闪烁计数仪(瑞典LKB公司出品，1209型)；分光光度计(上海分析仪器厂出品，751型)。二、实验方法：1.动物模型复制：健康Wistar大鼠24只(250350 g)，雌雄兼用，随机分为3组，每组8只。Ischemia-reperfusion(I-R)组 ：20%的乌拉坦(0.5 mL/100 g)ip麻醉，行颈部手术，分离

10、两侧颈总动脉，于甲状软骨上缘右侧分离肌肉至枕骨腹面，先在枕骨嵴旁钻1小孔，扩大为3 mm×2 mm大小的骨窗，暴露基底动脉，用特制无损伤的动脉夹夹闭上述3个动脉，脑电变为一平线，观察120 min，然后将3个动脉夹全部放开，继续观察30 min。I-R+地塞米松组于夹闭血管前10 min静脉推注地塞米松(10 mg/kg)，手术过程同I-R组。假手术对照组实验过程基本同I-R组，但血管不夹闭。实验完毕后断头取脑，按自然分界分离皮层、海马、纹状体，液氮冷冻，-70冰箱保存。2.谷氨酸转运体膜颗粒的制备：参照Gilia4方法分别制备皮层、海马、纹状体突触膜颗粒。脑组织以10倍冰冷的匀浆液

11、匀浆后，再以6000 r/min离心10 min取上清液，依次加低张、悬浮、装载缓冲液分别在4、1500 r/min离心20 min，均取沉淀，最终加装载缓冲液备用。3.谷氨酸转运体功能的测定：取突触颗粒20 L加入膜外液(0.15 mol/L NaCl 180 L， 0.25 L 3H-L-谷氨酸)中，置30水浴中反应10 min，用2 mL冷0.15 mol/L NaCl终止反应，迅即再加24 mL冷NaCl液，以0.45 m滤膜定时冲洗抽滤，滤膜烘干并置入液闪瓶中，加甲苯闪烁液，隔夜经液体闪烁仪测定。样本均做双管。膜颗粒的蛋白质含量测定采用Lowry's法。谷氨酸转运体功能表达为

12、3H-L-谷氨酸摄入量(pmol*min-1*mg-1Pro)。4.SOD活性、MDA含量的测定：准确称取脑组织，按试剂盒规定步骤加样、温育，在532 nm处比色测定。SOD采用1%的匀浆，活力单位为U/mg；MDA采用10%的匀浆，其含量单位为nmol/mg湿重；5.统计学处理：实验结果以±s表示，两组间比较采用方差分析，q检验。结果一、大鼠脑缺血-再灌注损伤时谷氨酸转运体功能的变化：I-R组的皮层、海马、纹状体突触颗粒谷氨酸转运体转运功能均明显低于假手术对照组(P0.05，P0.01)。I-R+地塞米松组谷氨酸转运体功能明显高于I-R组(P0.05，P0.05，P0.01)，与假

13、手术对照组无明显差异(P均0.05)。见表1。表1大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织3H-L-谷氨酸摄入量的变化及地塞米松的影响Tab 1 Changes of 3H-L-glutamate uptake during ischemia-reperfusion injury of rat brain and antagonistical effect ofdexamethasone (pmol.min-1.mg-1 Pro,±s，n=8)GroupCerebral coxtexHippocampusStriatumControl1.77±0.397.87±0.7940

14、.42±15.86I-R1.37±0.226.05±1.4618.42±4.07*I-R+Dexamethasone1.71±0.388.60±1.6139.50±11.3*P0.05，*P0.01，vs control group;P0.05，P0.01，vs I-R group 二、大鼠脑缺血-再灌注损伤时SOD活性的变化：I-R组的3个部位的SOD活性均明显低于假手术对照组(P0.05，P0.01)。I-R+地塞米松组明显高于I-R组(P0.05，P0.01)，与对照组相比，无明显差异(P均0.05)。见表2。表2大鼠

15、脑缺血-再灌注损伤时脑组织SOD活性的变化及地塞米松的影响Tab 2 Changes of SOD activity during ischemia-reperfusioninjury of rat brain and antagonistical effect of dexamethasone (Umg，±s，n=8)GroupCerebral coxtexHippocampusStriatumControl117.54±4.51124.64±15.42108.80±5.68I-R110.55±5.08*104.20±6.87*99

16、.31±6.70*I-R+Dexamethasone120.37±4.44112.89±6.53115.14±5.16*P0.05，*P0.01，vs control group;P0.05，P0.01，vs I-R group 表3大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织MDA含量活性的变化及地塞米松的影响Tab 3 Changes of MDA content during ischemia-reperfusion injuryof rat brain and antagonistical effect ofdexamethasone (Umg，±s

17、，n=8)GroupCerebral coxtexHippocampusStriatumControl20.13±0.7515.93±1.6016.03±2.36I-R22.27±1.82*19.10±0.94*20.03±1.86*I-R+Dexamethasone20.78±1.8716.21±2.5716.77±2.42*P0.05，vs control group 三、大鼠脑缺血-再灌注损伤时MDA含量的变化：I-R组的3个部位的MDA含量明显高于假手术对照组(P0.05，P0.01)。I-R+地

18、塞米松组明显低于I-R组(P0.05，P0.01，P0.05)。与对照组相比，无显著性差异(P均0.05)。见表3。四、相关性：I-R组的皮层、海马、纹状体的谷氨酸转运体的转运功能降低与MDA含量升高呈负相关(r=-0.900，-0.923，-0.748，P0.01，P0.05)，与SOD活性呈正相关(r=0.847，0.894，0.973，P0.01)。讨论近年的研究证实：谷氨酸系统在缺血、缺氧导致的神经损伤中可能起关键作用1。正常时由于神经细胞和神经胶质细胞脂质膜上的谷氨酸转运体能很快地清除前膜所释放的谷氨酸，使其不致于发生神经毒性6。有资料证明：在缺血的突触小体谷氨酸的再摄取功能受到了损

19、伤7，甚至在缺血后再灌注，当正常代谢及离子梯度恢复后，谷氨酸的摄取功能也不能迅速恢复8。缺血及其再灌注时形成的大量自由基，从多个方面影响细胞的代谢和功能。有报道，自由基的形成和兴奋性谷氨酸的毒性作用可能存在着相互依赖性2。在体外培养星形胶质细胞的实验中证实8，当给予自由基形成系统黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶时可减少高亲和力谷氨酸转运系统清除细胞外谷氨酸的能力。当将培养的细胞放入含有氧自由基的环境中，其细胞转运谷氨酸的能力就被进行性地抑制；当自由基被清除剂清除或移去时，这种抑制作用就会消失。也有报道7，伴有脂质过氧化的急性和慢性神经退行性疾患，其脑组织谷氨酸转运体的功能降低。本文的结果显示，在脑缺血-再

20、灌注损伤时皮层、海马、纹状体的谷氨酸转运体的功能明显降低，并与SOD活性呈正相关，与MDA含量呈负相关。表明脑缺血-再灌注损伤时谷氨酸转体功能的降低导致神经元突触间隙的谷氨酸的过多积聚而产生神经毒性作用，而谷氨酸转运体功能降低则可能与氧自由基生成过多有关。若谷氨酸转体功能降低能被预防或很快地逆转，脑缺血-再灌注导致的神经元损伤则可减轻或恢复。也有资料证实9，预先应用糖皮质激素可能减少-氨基丁酸的摄取；预先大剂量静注地塞米松能减少3H-谷氨酸与受体的结合。因此本实验选择地塞米松作为自由基清除剂看是否对脑组织谷氨酸转运体功能也有影响本实验结果证实：地塞米松不但有拮抗自由基的作用，而且对谷氨酸转运体

21、功能有保护作用。*国家自然科学基金资助(No.39400051)作者单位：任晓燕曲忠森葛宝林张玉敏：青岛大学医学院病理生理学教研室(青岛 266021)徐珞：青岛大学医学院生理学教研室参考文献1Rothman SM,Olney JW.Glutamate and the pathophysiology of hypoxic-ischemia brain damage.Ann Neurol,1986,19:105.2Drejer J,Benveniste H,Diemer NH.Cellular origin of ischemia-induced glutamat erelease from brain in vivo and in vitro.J Neurochem,1985,45(1):145.3Monyer H,Hartley PM,Choi DW.21-Amino steroids attenuat