特定结合分子固定化表面对於内毒素吸附行为之评估

1、特定結合分子固定化表面對於內毒素吸附行為之評估An assessment on specific-binding ligand immobilized surface for endotoxin adsorption 陳秀綾老師 國立瑞芳高級工業職業學校 中文摘要本研究擬探討不同特定結合分子固定化表面與細菌內毒素彼此間特異性吸附的行為。研究中將探討普遍使用於敗血症治療時所使用的抗生素與內毒素分子之作用，利用表面電漿共振(SPR)之流動吸附系統線上偵測其彼此間專一性動態吸附行為, 並將吸附實驗所得結果進行與理論模型分析，進一步計算平衡與動態參數。SPR晶片表面將搭配以橢圓儀、接觸角量測儀測定表面

2、膜厚及親疏水性質、FTIR或ESCA量測修飾表面之官能基與分佈狀況來進行固定化表面之定性測試,及評估不同抗生素對於移除細菌內毒素之效能評估。初步測試SPR系統進行蛋白質吸附金面的清洗實驗，結果確定以0.5% SDS界面活性清洗劑流過晶面並無法徹底清除吸附在金面之HAS分子。未來工作將進行內毒素與抗生素固定化表面分別對於對應分子間特異性吸附之行為進行研究探討，進而評估篩選較適合用於作為發展體外血液灌注處理器之表面固定化抗生素分子。關鍵詞：內毒素；特異性吸附；表面修飾；抗生素AbstractVarious specific-binding ligand immobilized surfaces f

3、or the performance of endotoxin adsorption will be evaluated in this study. The interaction between endotoxin and antibiotics generally used in treating sepsis will be studied. A flow system with Surface Plasmon Resonance (SPR) is used to monitor the dynamic behavior of this specific adsorption. Exp

4、erimental data of SPR are fitted to theoretical model to determine the equilibrium binding, dynamic dissociation, and association constants. Accompanied with the thickness measurement of binding molecules via ellipsometry, hydrophilicity characterization by contact angle measurement, and the presenc

5、e of specific functional group or chemical compositions by FTIR or ESCA, the capability of specific antibiotics on the removal of endotoxin are evaluated. Preliminary tests focused on evaluating cleanness methods for Human Albumin adsorbed surfaces and found that by purging with a 0.5% SDS surfactan

6、t solution cannot thoroughly remove the adsorbed protein from the surface. In the next, we shall study the adsorption behavior of antibiotics to endotoxin immobilized surface, and the adsorption behaviors of endotoxin to antibiotics immobilized surface as well. The specific binding behaviors between

7、 endotoxin with preferred antibiotics shall be further evaluated for the development of an antibiotics immobilized extracorporeal hemoperfusion device.Keywords: endotoxin, specific adsorption, surface modification, antibiotics.前言 雖然近來在手術技巧、重病特別護理、以及多樣抗生素的便利取得上，已有長足之進步。然而敗血病以及嚴重的敗血性休克卻仍是已開發國家中重症病患的主要

8、死亡原因之一，其死亡率更有可能高達50%以上 1。來自格蘭氏陰菌細胞壁所釋放出來的內毒素(Endotoxin)在此致病的機轉中扮演了一個重要的角色2, 3；因此，越來越多研究的目的是著眼於建立與內毒素分子具有高特異性結合能力分子的固定化的表面，藉著直接透過血液灌注的方式在病人體外透過吸附的方式來移除此重要的致病毒素，進而達到治療的成效。目前已在日本臨床上使用的Toraymyxin就是透過Polymyxin B分子的固定化來達成上述的效果。因此，文獻上仍有許多其他候選分子持續地被研究評估當中 5。然而，Toraymyxin的臨床評估報告卻顯示，受試者的存活率與殘留在血液中內毒素的濃度卻往往具有一

9、定程度的差異性4。本研究希望透過探討與內毒素具有特異性結合能力的分子其靜動態吸脫附行為的檢測，來分析求得其作用之熱力學平衡與動態吸附參數值。最終目的希望可作為用來發展一具有針對於內毒素較高普遍使用性裝置之參考。實驗方法與工具 本研究主要包括：（一）LPS與抗生素之表面固定化，（二）固定化表面定性，（三）LPS及抗生素分子吸附性及（四）吸附參數理論分析等四部分工作。在分子固定化之實驗的設計上，大致分為兩部分，分別為（一）細菌內毒素的表面固定化與（二）抗生素固定化表面的吸附實驗：在第一個階段我們將把內毒素固定在抗非特異性吸附的SAM上，進行初步的抗生素的篩選。實驗的過程中，利用接觸角的量測可以試著

10、判別內毒素分子在表面固定方位，使用表面官能集團與膜層的測量可以確定成膜系統的穩定性，並可進一步判別下一階段所選定的抗生素可用於表面固定化的官能集團，以避免影響與內毒素間的特異性吸附行為。此實驗系統將建構在一個以雙硫鍵結來固定內毒素的表面，目的是希望可以產生一個可以重新固定內毒素的新表面，不受到先前吸附實驗殘餘的影響。內毒素的表面吸附量將以SPR的訊號來判定表面的固定情況。實驗將對於經固定化處理之表面進行各種定性測試，其中包括以橢圓儀進行膜厚的量測、以接觸角量測來定量表面的親疏水性質並且搭配FTIR或ESCA的量測來偵測表面之官能基與膜層之組成成分。抗生素固定化表面的吸附實驗將直接模擬體外血液灌

11、注移除內毒素的系統。同樣以前一階段所述的各種表面定性方式來確定成膜分子的排列情況，並搭配橢圓儀量測膜厚的方式來定量抗生素於SAM表面以共價性鍵結固定的情況，用以定量抗生素與SAM膜的表面結合比率。 SPR所量測到的訊號變化首先將代入Langmuir model來進行與理論模型彼此間合適情況的探討，用來決定內毒素分子與所選定抗生素間(a)平衡參數(Kd)(b)動態脫附參數(Koff)和(c)動態吸附參數(Kon)的計算與進一步配合上述表面的定性測試來探求彼此間的結合狀況，並同時參考Biacore系統本身所附的BIAevaluation套專軟體進行上述平衡與動態參數的求得，抑或進行更一步理論模型複

12、雜化的修訂，來求得最合適描述實驗結果理論模型的反應動力學參數。初步結果SPR系統測試(圖一)，主要是想利用線上進行人類白蛋白吸附金表面的線上清洗，測試儀器中心內BiacoreX系統的操作穩定性，亦同時評估吸附蛋白質的脫附行為來得知線上清洗晶片的可行性。測試上分為蛋白質短暫吸附(a)與使其在界面停滯一段時間(b)在金表面上兩個部分，後者實驗設計的目的是用來模擬已長時間未經清洗的蛋白質吸附表面。從實驗的結果看來，無論(a)和(b)兩個部分都無法使得訊號在清洗過後回到基準線(baseline)，金表面所具備相當大的表面能，仍使得吸附在金表面的蛋白質無法從界面上脫附下來，因此後續的表面固定化方法將設計

13、鎖定在可重新產生可重新接附固定結合分子的表面，同時降低實驗成本的支出並避免之前吸附實驗殘留所造成的影響。 （a） （b）圖一，（a）直接對剛吸附Human Albumin的金表面 （b）對在已停滯一段時間(4hours30mins) Human Albumin的金表面進行表面流過界面活性劑與緩衝液的線上清洗，圖中箭頭所指的位置代表在流動系統中灌注不同時間間期(相同流速下)界面活性劑的起始時間點。未來工作 接著會進行不同濃度欲進行篩選的抗生素與內毒素分別流過細菌內毒素的表面固定化與抗生素固定化表面進行吸附實驗，將結果套入合適的理論模型量化地計算分析平衡與動態參數來探討內毒素與抗生素間的特異性交互作用，並驗證實驗系統建立與操作執行過程的合適性。此外，分子的固定化修飾表面會透過利用橢圓儀量測膜厚、接觸角量測決定表面親疏水性質與表面官能基的偵測與膜層成分的分析進行表面定性，以確定修飾表面處理後組成成分的正確性。參考文獻 1. Angus, D. C., et al. Crit. Care Med. (2001) 29: 1303.2. Opal, S. M., et al.