DC细胞制备标准操作程序

1、C 细 胞 制 备 标 准 操 作 程 序目的和范围：1.1 目的：规范DC细胞培养操作流程，保证细胞产品制备的稳1.2定性、均一性。范围：适用于实验室细胞培养技术人员DC细胞培养的全过程。原理：2.1外周血PBMC经细胞因子诱导可分化为 DC细胞。相关文件：3.1CIK 细胞制备标准操作规程记录4.1DC-CIK细胞制备记录。物料：5.1试剂：75%酒精，碘伏，生理盐水，淋巴细胞分离液 （ Ficoll ），GT-T551培养基，自体血清，DC因子-1 , DC因子-2，肿瘤蛋白等。5.2仪器设备：生物安全柜，离心机，水浴锅，二氧化碳细胞培养箱， 电动移液枪， 10ul 移液枪， 医用剪刀，

2、 医用止血钳，试管架。5.3耗材：T25 培养瓶(25cmFlask ) , T75 培养瓶(75cFlask )15ml 离心管， 50ml 离心管， 5ml 移液管， 10ml 移液管， 200ul枪头。6 职责：6.16.26.3审核人负责保证本规程的审核和全过程准确有效。细胞培养技术人员应严格按照本规程的规定进行DC细胞培养操作。QA负责监督细胞培养技术人员的操作全过程，确保DC细胞培养操作的规范性。7 工作程序：7.1 实验前准备：7.1.1 洁净区需经过紫外线照射，连续照射时间不得低于30min. ，实验过程中风机始终保持开启状态。7.1.2生物安全柜需经过开机紫外线照射， 连续照

3、射时间不得低于30min。并且开启生物安全柜玻璃防护窗，待生 物安全柜内部气流稳定后，才可使用。7.1.3 将实验所需器械放于物料传递窗进行紫外照射，械必须是经过高压灭菌锅消毒灭菌，并且在合格期以 内）照射完毕后将器械盒用酒精进行擦拭消毒后，放入 生物安全柜中备用。7.1.4 单核细胞分离液（ Ficoll ），培养基，应提前准备好放入生物安全柜中，以便其回复常温，否则将会影响实 验效果。7.1.5 DC因子-1及DC因子-2在使用时置于冰块上方，即用即取，禁止在常温下长期放置。7.2 分离培养7.2.1 按照CIK细胞制备标准操作程序所述的方式分离提取 PBMC。7.2.2 接种：7.2.2

4、.1 用 GT-T551 培养基（加 10%自体血清）调整田胞浓度为 56 106/ml ，铺入细胞培养瓶中，标记， 水平放入37 C, 5%Ca田胞培养箱内，若非透气孔培养瓶，应拧松瓶盖一圈。7.2.2.2 -3 小时后 （拧紧瓶盖），取出，（注意轻拿轻放）经消毒后放入生物安全柜中。7.2.2.3 沿培养瓶反面将细胞悬液全部倒入离心管中。7.2.2.4 用 5mlGT-T551 培养基（加 10%自体血清）刷洗培养瓶，涮洗液也倒入离心管中。7.2.2.5 离心管中细胞悬液做 CIK 培养（详细步骤参照CIK细胞制备标准操作程序）。7.2.2.6 沿原培养瓶反面加入 10mlGT-T551 培

5、养基（加10%自体血清）。7.227 加入DC因子-1，分装量10ul/支，每10ml培养基可添加 1 支（培养基不足 10ml 时按比例添 加）。7.2.2.8 标记，水平放入 37C, 5%CO细胞培养箱培养。7.3 换液：7.3.1 第一次直接加液5ml，换液方式如下:7.3.1.1 准备耗材至生物安全柜： 15ml 离心管 1 个，GT-T551培养基（加10%自体血清），DC因子-1 ;7.3.1.2 7 步骤。7.3.1.3 从培养箱中取出培养瓶，将离心管中培养基沿反面倒入培养瓶。7.3.2 第二次开始半量换液，换液方式如下:7.3.2.17.3.2.2从培养箱中取出培养瓶，用移液

6、管取半量培养基至15ml 离心管中7.3.2.31200rpm， 8min ，去上清，加入已配制的培养基，重悬，混匀。7.3.2.4 沿培养瓶反面倒入培养瓶中，转移至CO2 细胞培养箱。7.4 24h后添加DC因子-2 :分装10ul/支，每20ml培养基可添加 1 支（培养基不足 20ml 时，可按体积比例进行添加）。7.5 DC成熟后（一般约24h），将DC细胞悬液转移至 CIK细胞悬液中共培养。7.5.1核对CIK细胞培养袋信息是否与 DC细胞信息相符。7.5.27.5.3轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入注射器中或移液管转移至CIK细胞培养瓶中。7.5.4 用 5-10m

7、l 培养基（含 10%血清）涮洗培养瓶，并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入注射器中或 CIK培养瓶中。7.5.5 移去注射器，拧紧盖子，标记，放入CO细胞培养箱。7.5.6 填写相关记录，清场。7.6 DC细胞收集回输：当 DC细胞直接用于回输时按以下步骤。7.6.1复核DC细胞是否与回输计划信息相符。7.6.2取样本，经酒精擦拭后放入生物安全柜。7.6.3取 50ml 离心管，标记，打开离心管管盖。7.6.4轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入离心管中。7.6.5用 5-10ml 生理盐水涮洗培养瓶， 并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入离心管中，1200rpm， 8min 。7.6.6

8、去上清，加入 45ml生理盐水重悬，取 0.5ml中间层细胞悬液计数及活率。7.6.71200rpm, 8min，用15ml 离心管取 15ml 上清做内毒素、革兰氏检测并留样，其余上清废弃。7.6.8 用生理盐水和自体血清重悬细胞至20ml （如无自体血清，用 5ml 人血白蛋白和 15ml 生理盐水重悬细胞至20ml）。7.6.9 转袋。（参照 CIK 细胞制备标准操作程序）7.6.10 用 10ml 生理盐水涮洗离心管，涮洗液也转入转移袋或生理盐水瓶。7.6.11 填写相关记录，清场。7.7 微生物检测控制点与回输质量控制：7.7.1 细胞接种前取单核细胞最后一次清洗上清2ml 液做微生物检测 （ 细菌培养和真菌培养 ）7.7.2 细胞回输前3-4天取样在培养的细胞悬液 2ml做微生物检测（细菌培养和真菌