NEB-T4-DNA-Lagase注意事项

1、一、关于 NEB M0202 T4 DNA连接酶的使用方法和常见问题及解答时间的结果。图2:在20 口1反？口逑抵校？貌煌？康腡4 DNA 连接酶连接平滑末端的入DNA/Hae m片段。16°C温育30.分钟。1、产品特性和使用方法产品说明：该酶催化契合的双链 端或粘性末端DNA之间的连接,DNA或RNA的5'-磷酸末端和3'-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末 还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA 杂交双链中的单链切口来源： 源于 E.coli C600 Pcl857 pPLc28 lig8 应用:限制性酶切片段的克隆（3）。I将linker或a

2、dapters 连接到DNA片段的平滑末端。反应缓冲液：1X T4 DNA Ligase Buffer:50 mM Tris -HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP , 25 卩 g/ml BSA, (pH 7.5 25 。推荐 DNA 浓度(0.1 - 的5'末端)。使用注意：ATP是反应必须的辅因子。这一点与要求NAD作辅因子的大肠杆菌 DNA连接酶不同。如在反应体系中补加1 mM的ATP ,连接反应还可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液（NEBuffers）或在T4DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。质量保证： 无核酸内、外切酶污染。每批T

3、4 DNA连接酶均通过模拟克隆实验进行检测, 末端的任何破坏。结果表明>99.9%的DNA末端未受任何降解。丨该实验可以检测岀待连接DNA单位定义（粘性末端活性单位）：在20卩1连接反应体系、0.12卩M （300卩g/ml）的5'-末端浓度条件下，16°C反应30分钟, 能使50%的经Hind m消化的 入DNA片段连接所需的酶量定义为一个NEB单位。一个粘端连接活性单位 =0.015个韦氏（ATP-PP交换）单位（4）。一个韦氏单位=67个粘端连接活性单位。浓度：400,000 units/ml和 2,000,000 units/ml贮存条件：50 mM KCl,

4、10 mM Tris -HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 卩 g/ml BSA和50%的甘油，-20 °C贮存。热失活条件：65 ° C加热10分钟。室温连接反应：为方便起见，连接反应可以在室温（20-25° C条件下进行。粘性末端连接：在 20卩1反应体系中加入1卩l T4 DNA连接酶，反应10分钟。平滑末端连接：在 20卩1反应体系中加入1卩l T4 DNA连接酶反应2小时，或 者加入1卩1高浓度T4 DNA连接酶反应10分钟。另外，NEB的快速连接试剂盒（Quick Ligation Kit, NEB #M2

5、200V 15 个反应）是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。图1:在25°C条件下，用1 unit （ 1:400稀释后取1卩T4 DNA连接酶连接 入DNA/Hind皿片段（4-碱基粘端）不同反应忖-SO' M* M图2 :在20卩反？卩逑抵校？貌煌？康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的入DNA/Hae皿片段。16°C温育30分钟。040 H 400uils r4DNA L0«e二、常见问题及解答Q1 :有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败A1 :反应体系内无 ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buf

6、fer或向其它兼容的 buffer中加入 ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加 ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP ,而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。DNA。反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA :保持总DNA浓度在1-10卩g/ml之间。连接末端为单碱基突岀末端：使用最高至5卩高浓度连接酶16 ° C过夜连接。插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而

7、引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的 引物或对引物进行磷酸化。50卩感受态细胞应加入 1-5卩连接混合物。加入过多的连接混合物至感受态细胞：插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶产生的大片段线性 DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（ NEB# M2200 ）的buffer含有PEG。电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方PEG。法纯化连接混合物。 虽然快速连接试剂盒 （NEB# M2200 ） buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞， 但是会抑制电转化, 所以必须去除，可用柱纯化方法

8、去除Q2 :解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？IA2 :感受态细胞岀了问题：设置下面列岀的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。细胞不是感受态：设置下面列岀的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。连接的DNA片段含有反向重复的序列， 表达系统。插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用 失菌株。重组子太大（10,000 bp ）不能进行化学转化：用电转化。IpMAL系统（NEB # E8000S ）表达 MBP（麦芽糖结合蛋白）融合蛋白，或者不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试

9、用其它不需要大肠杆菌的mcrA、mcrBC 和 mrr 缺T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败?Q3 :内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致A3 :内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于 PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化 DNA。内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了 DNA末端：酚/氯仿抽提纯化 DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接 QC不佳或外切酶活性高，

10、减少内切酶量或縮短反应时间。IDNA。Q4 :使用T4 DNA 连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和A4 :注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗 生素的平皿上。I转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1 %。1相近。酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1的1%。Q5 :什么情况下选用 T4 DNA连接酶?A5 :

11、 T4 DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温 2小时），或者连接反应需要过夜。如果需要热失活连接酶，选用用T4 DNA连接酶。高浓度 T4 DNA连接酶被用来连接单碱基突岀末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC （细菌人造染色体）结构。IQ6 : T4 DNA 连接酶能与快速连接 buffer兼用吗？ T4 DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15A6 :可以，高浓度 T4 DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。Q7 : T4 DNA 连接酶连接应该加

12、多少 DNA ？A7 :单位定义用的是 0.12丛M （300 丛g/ml） lambda Hi nd。高浓度的 DNA用于lin ker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总 DNA浓度于较低水平。载体+片段总浓度应为：1-10卩g/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于 2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。IQ8 : T4 DNA 连接酶可在其它 NEBuffers中使用吗？A8 :连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer中进行，但需要加终浓度为补加的是核糖核

13、酸ATP,而不是脱氧核糖核酸ATP,因为后者不起作用。当使用 NEBuffer 3时，如果 高可导致连接效率下降。Q9 : T4 DNA连接酶可以热失活吗？A9 :可以，65 °C孵育20分钟可以失活。如果buffer【快速连接试剂盒(NEB# M2200 )内的buffer】可热失活，否则会抑制转化。1mM ATP。确定DNA中盐浓度较中含有PEG则不Q10 : Weiss单位(韦氏单位)与 NEB粘性末端单位如何换算?二、关于 NEB M2200 T4 DNA快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答A10 :一个NEB粘性末端单位等于 0.015 Weiss 单位，即一个 Wei

14、ss单位等于67个NEB粘性末端单位。1、产品特性介绍以及使用方法产品说明：本试剂盒可在室温(25 ° C)5分钟条件下，完成 DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。应用:DNA片段克隆入载体 文库构建TA克隆Linker连接线性DNA的再环化 快速连接试剂盒的优点: 快速-粘性末端或平滑末端 DNA片段的连接只需 5分钟即可完成 方便-可在室温条件下进行连接反应灵活-适合于各种常规连接反应 试剂盒成分:Quick T4 DNA 连接酶(重组酶)2X Quick Ligati on Buffer 贮存条件 (连接酶)：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.

15、4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 卩 g/ml BSA 和 50% 甘油。2XQuick Ligation Buffer : 132 mM Tris -HCI， 20 mM MgCI2 ， 2 mM ATP，15%Polyethylene glycol(PEG 6000)*， pH7.625 °C。*美国专利号：4,582,802。注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。快速连接步骤：加入 10 a l 2 X Quick Ligation Buffer，混匀。加入1卩l Quick T4 DNA连接酶，彻底混匀。稍事离心，室温 （25 °

16、C）作用5分钟。 冰上冷却，然后转化或贮存于 -20°C。I 不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化,NEB推荐下述转化方法:冰上融化感受态细胞。在1.5 ml微量离心管中，将约 5 ng （2卩的连接混合物冷却。在DNA样品中加入50卩1感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。 冰上放置30分钟。37 °C热休克2分钟，冰上冷却 5分钟。 加入950卩1室温培养基，37°C温育1小时。取100卩1样品铺在适宜的培养基上。37 °C培养过夜。注意事项：用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在 上，连接两小时后转

17、化效率便会降低，如果25° C 5分钟达到反应终点，超过这个时间效果并不会更好。25 °C反应过夜，则转化效率会降至75%。事实待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水Quick Ligation Buffer前，调整载体 DNALigati on Buffer的体积使之占总反应体积的（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。 要获得最适连接, 和插入片段的体积到10 alDNA片段体积大于10卩的，则相应增加50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。在加2X2X Quick为保证有效连接， 最好，低于2:1 比例做几个连接反应。2-6之间总的载体DNA+插入片段

18、的浓度应当在1-10卩g之间。对单插入来说，插入片段：载体比例在就会导致低的连接效率，高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的PEG浓度。我们推荐使用柱电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低 离心式DNA纯化方法。连接进程曲线：LITMUS28载体（NEB #N3628）经EcoRffl切割（平滑末端）或Hind皿切割（粘性末端）后，小牛肠碱性磷酸酶 处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自X174 DNA的Hae皿消化产物（平滑末端）或入DNA的Hind皿消化产物（粘性末端），分别以3:1的插入片段：载体比例按照快

19、速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞，在 LB-am p平板上37 °C生长过夜。0115LI vitiwi raint liQntim10*I I I I I I I - 51Dlim, 4n)inutpcl限制性酶切片段的克隆（3）。2、快速连接试剂盒常见问题及解答Q1:在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化?A1:可能的原因有：快速连接反应被热失活了。快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。快速连接混合液在电击之前没有纯化。快速连接缓冲液中含有的纯化连接产物。过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在

20、的也不会获得更好的效果。反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应。可以纯化一下PEG会阻止电击反应。可以应用商业化的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过DNA。DNA纯化柱30min，脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP ）没有完全失活或去除。可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶（NEB#M0289 ）。因为热敏磷酸酶在 65 °C 5min即可完全失活而无需纯化 另外一些影响因素：I缓冲液超过一年，其中的ATP已经降解。补加新鲜的 ATP至终浓度为1mM。DNA浓度过高，连接产物只有线性分子。建议总DNA。插入片段和载体没有磷酸基团。DNA浓度在1-10卩g/ml之间。50卩丨感受态细胞中加入1-5卩丨混合物感受态细胞中加入的连接反应混合物过多。建议用量：插入片段长度超过 10 kb，反应条件无法满足环化要求。可以降低插入片段浓度。I限制性内切酶切割不完全。当用于PCR产物末端的切割时，建议在两端的酶切位点上加至少限制性内切酶没有完全热失活。如果选用的内切酶不能被热失活可以用酚6个保护碱基。/乙醇纯化DNA。内切