CRISPRCas9基因敲除质粒使用说明书

1、CRISPR/Cas9基因敲除质粒使用说明书重要提示：1. 收到质粒产品后，请将产品至于-20环境中保存；2. 本公司提供的敲除质粒只保证在基因组水平有敲减；3. CRISPR/Cas9基因敲除质粒，转染目的细胞后务必筛选单克隆细胞进行后续实验，不可直接进行后续实验；CAS9敲除靶基因的碱基数量是随机的，只有敲除的碱基数为非3的整数倍时，才有可能导致基因出现移码突变，蛋白翻译提前终止致使基因失活。 不筛选单克隆，其他非有效敲除将影响后续的蛋白检测及功能实验。4. 本公司提供的CRISPR/Cas9基因敲除质粒载体源于MIT张峰实验室，载体图谱信息如下：实验操作流程：一 、质粒转染（以目的质粒转

2、染一个孔的293T细胞为例）a. 转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的 293T 细胞，重新接种于 6孔种 细胞培养皿，37 、5% CO2 培养箱内培养，待细胞密度达80%90%时即可用于转染； b. 转染前 2 h将更换细胞培养基培养基为Opti-MEM，800ul/孔； c. 向一灭菌离心管中加入4ug目的质粒, 与Opti-MEM混合均匀总体积调整至250ul， 在室温下温育 5分钟；d. 向一灭菌离心管中加入10ul Lipo 2000, 与Opti-MEM混合均匀总体积调整至250ul，在室温下温育 5分钟；e. 将上述两管混合，配制成总体积为500ul的转染体系，在室温下

3、温育 20分钟；f. 将上述转染体系滴加至6孔板细胞表面，轻轻摇匀，至于37 , 5% CO2细胞培养箱中培养。g. 8-10h后更换新鲜的完全培养基继续培养。二、嘌呤霉素筛选及基因组提取a. 细胞转染后48H，将细胞培养基更换为含有嘌呤霉素（2ug/ml ，不同细胞的药物浓度不一致）的完全培养基（10% DMEM）；b. 药物筛选作用24H 后细胞，部分细胞死亡（未成功传染进质粒），存活的细胞进行换液处理（嘌呤霉素，2ug/ml ， 10% FBS DMEM）。c. 至细胞长满后，收取细胞，提取基因组DNA（天根细胞基因组抽提试剂盒Cat:DP304-02）三、 基因组水平基因敲除检测a.

4、设计PCR引物：在gRNA靶位点的基因组序列（非转录本CDNA序列）上下游设计PCR引物，PCR产物在500bp左右为佳；b. PCR扩增出靶位点区域的基因组片段，纯化回收后用T7E1酶切鉴定。举例：a) PCR反应体系： 组分名称用量基因组模板:1ulPrimer-F(20um):2ulPrimer-R(20um):2ul2X PCRmix(天根):25ulH2O:XTotal50ul b) PCR反应循环设置： 95 1min 95 20sec 60 20sec 72 60sec 35 cycle 72 1min 4 hold c) PCR产物特异性鉴定 取 PCR产物5ul，1% agr

5、ose ，DNA 电泳鉴定。电泳检测：d) PCR产物纯化回收试剂盒：天根 DNA 纯化试剂盒(DP205) e) 程序退火 退火体系 组分用量PCR 纯化产物18ulNEB buffer 22ul总体积20ul退火程序 95 10min90 3min85 3min80 3min. 每个循环减 5.25 +f) T7E1检测 组分用量PCR 程序退火产物20ulT7E11ul37 酶切 1h1.5h2% agrose ，DNA 电泳鉴定检测。电泳检测（双载体系统为例，结果显示：目的基因在靶位点处有敲除）四、 单克隆细胞筛选a. 带有嘌呤霉素抗性的目的细胞， 待细胞密度生长至90%时，常规消化后

6、接种于96孔板中，调整接种的细胞密度为1-1.5个/孔 ；b. 继续培养两周左右，期间适时补液或换液，待孔板中细胞长至细胞克隆时，挑取阳性细胞克隆至24孔板中扩大培养。c. 收取24孔板中的部分细胞，抽提基因组DNA，进行PCR扩增产物测序检测（PCR扩增引物和方法同基因组水平基因敲除检测实验）d. 测序结果为单峰、碱基确实数不为3的倍数的单克隆细胞可以进一步的扩大培养，直至获得需要的细胞量。 Fig1. 敲除的碱基数不为3的倍数，单峰。该单克隆细胞是可以进行后续实验的。 Fig2. 本图中敲除位点附近序列出现有套峰，即所筛选的细胞为非单克隆细胞，不可以用于后续实验。 五、 筛选出符合要求的单克隆细胞可以用于后续的WB检测或功能实验。参考文献：1. F Ann Ran. et al，Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system，nature protocols， 11 ， 2281-2308 ( 2013)；2. Kavlashvili T. et al ,Invers