粘红酵母delta1脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

1、粘红酵母？12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达杨晓霞，何仕武，魏云林，林连兵，季秀玲，张琦*昆明理工大学生命科学与技术学院昆明 650500摘 要 A2-脂肪酸脱氢酶一般特异性在18C油酸第12碳原子引入双键转变成亚油酸。为了从粘红酵母YM25079中克隆全长A12-脂肪酸脱氢酶基因序列，本研究参考已知的-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物，通过 PCR扩增获得到全长为1353bP的cDNA序列，序列分析结果表明该序列具有一个编码 450个氨基酸的一个完整开放阅读框，所编码蛋白质的大小为50.9KD。与报道的A12-脂肪酸脱氢酶一样，推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保

2、守区，表明该序列为一个新的编码A12-脂肪酸脱氢酶的基因。为了验证其功能，把开放阅读框序列亚克隆到表达载体PYES3/CT，构建重组表达载体PYRGD12，并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过脂肪酸气相色谱 （GC）分析表明，该序列所编码的蛋白质具有A12-脂肪酸脱氢酶活性，能将油酸转化为亚油酸，亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的4.31%。关键词 粘红酵母；A12-脂肪酸脱氢酶；亚油酸；克隆和表达CLC Q933Cloning and heterologous exp ression ofOT-desaturase gene fromRhodotorula glutinisYAN

3、G Xiaoxia, HE Shiwu, WEI Yunlin, LIN Lianbing, JI Xiuling & ZHANG Qi收稿日期 Received:接受日期 Accepted:资助：国家自然科学基金项目(No. 31160016)，云南省应用基础研究基金资助项目(No. KKSA201126005)、教育部回国人员科研启动基金(No. KKQA201226003)资助.Supported by the National Natural Scienee Foundation of China (31160016), the Application andBasic Res

4、earch Fund of Yunnan Province (KKSA201126005), the Scientific Research Foundation for Returned Overseas Chinese Scholars, State Educatio n Mi nistry of Chi na. (KKQA201226003) 通讯作者Corresponding author (E-mail: qzhang37)Faculty of Life Scie nee and Tech no logy, Kunming Uni versity of Scie nee and Te

5、ch no logy Kunming 650500, ChinaAbstract12Objectives:? - fatty acid desaturase generally introduces a new double bond specifically at A 123osition of 18C oleic acid to generate linoleic acid. This study is to clone the full- length ?12- fatty acid desaturase gene fromRhodotorula glutinis strain YM25

6、079.12Methods: Based on the sequence information of the known yeast ? - fatty acid desaturase genes, a pair of specific12primers was designed and used for the ampiification of YM25079 ? - fatty acid desaturase gene. The obtained sequence was further transformed into Saccharomyces cerevisiaestrain IN

7、VScI for functional analysis.Results: A full-length cDNA sequence of 1353bp was amplified from Rhodotorula glutinis YM25079. Sequence analysis showed this sequence comprised an open reading frame encoding 458 amino acids of 50.9KD. The deduced amino-acid sequence showed similarity to the known ? 12-

8、fatty acid desaturases which comp rise three characteristic conserved histidine-rich regions for the membrane-bound desaturases, indicating this cDNA sequence is a novel ?12-fatty acid desaturase gene. The sequence was further cloned into the expression vector pYES3/CT to generate a recombinant plas

9、mid pY3RGD12, which was subsequently transformed intoSaccharomyces cerevisiaestrain INVScl for heterologous exp ression. Total fatty acids analysis of the transformed yeast cells by gas chromatography (GC) showed that a novel peak corresponding to the standards of linoleic acid methyl ester was dete

10、cted with the same retention time, which was absent in the cell transformed with empty vector. The ratio of this new fatty acid to total fatty acids was 4.31%.12Conclusion: The PCR-amplified sequence whose coding product exhibited ? -fatty acid desaturase activity to 12convert specifically oleic aci

11、d to linoleic acid is a novel ? -fatty acid desaturase gene.12Keywords Rhodotorula glutinis ; ? -fatty acid desaurase gene; linoleic acid; cloning and expression多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids, PUFAs )是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为18 22的直链脂肪酸 1。很多研究表明，诸如花生四烯酸AA(Arachidonic acid ARA, 20:4n-6 )、二十碳五烯酸EPA( E

12、icosaPentaenoic acid, C20:5n-3 )和二十二碳六烯酸 DHA ( Docosahexaenoic acid, 22:6n-3 )等长链多 不饱和脂肪酸是细胞膜的重要组成成分， 同时也是动物和人体中激素类 (Hormone-like )生物活性物质的前 体，在细胞膜的结构和功能调节、抗肿瘤抗炎、促进细胞生长、防止心脑血管疾病、有利于大脑视网膜形 成、免疫调节和基因表达等很多重要的生理调节功能2'3。PUFAs广泛存在于各种生物中，其合成是从18C的饱和脂肪酸合成途径上扩展的，在真核生物中饱和的硬脂酸(Stearic acid)经过?9-脂肪酸脱氢酶的催化转化成

13、油酸(Oleic acid, OA )，然后经？12-脂肪酸脱氢酶的催化进一步转化成亚油酸( Linoleic acid, LA )， 后者进一步进入n-3和n-6途径在不同脂肪酸脱氢酶(Fatty acid desatureas©和延长酶(Elongase)交替催化 下，合成各种不同的PUFAs，因此？ 12-脂肪酸脱氢酶催化合成LA是PUFAs合成关键步骤4'5。自首次从耐冷的蓝细菌(Synechocystis sp.) PCC6803中克隆到？12-脂肪酸脱氢酶基因以来，已经从 不同植物、 动物和微生物中分离到很多类似的功能基因序列， 功能分析结果表明 ?12-脂肪酸脱

14、氢酶主要功能 是在油酸( ?9)的第 12和13位碳原子之间插入一个双键，形成含有 2个双键的亚油酸( ?9, 12)，具有 底物链长特异性 7。但是，近年来对一些真菌和原生动物来源的?12-脂肪酸脱氢酶体外功能验证结果表明，该酶没有底物链长特异性，而是具有多功能特点8。比如线虫(Caenorhabditis elegans) ?12-脂肪酸脱氢酶CeFAT-2具有双功能的 宀5-脂肪酸脱氢酶活性，而且脂肪酸底物的碳链长度可在C14到C18范围内9。高山被抱霉(Mortierella alpina ) IS-4中的33-脂肪酸脱氢酶(MAW3 )也被证明具有三功能的® F/ q-脂肪

15、酸脱氢酶，其对不同类型的脂肪酸底物具有不同的脱氢活性10。我们前期的研究结果表明，粘红酵母( Rhodotorula glutinis )YM25079 随着培养温度下降，细胞中 PUFAs 合成增加，维持了细胞膜的流动性和 基本功能，而且 PUFAs 合成增加与粘红酵母 YM25079 中潜在的 ?12-脂肪酸脱氢酶基因的 mRNA 表达水平 的提高有关 11。在此基础上，本研究从 YM2079 中克隆?12-脂肪酸脱氢酶基因的全长编码序列并在酿酒酵 母中进行功能验证，这将有助于丰富脂肪酸脱氢酶基因资源，阐明菌株中PUFAs合成的相关生化途径，同时了解低温条件下 YM25079 中 PUFA

16、s 合成的调节机制以及通过遗传学手段在粘红酵母中或者其它细胞中 合成特定的PUFAs，为将来的相关研究打下基础。1 材料和方法1.1 菌株和质粒粘红酵母(Rhodotorula glutinis ) YM25079、大肠杆菌(Escherichia coli) DH5 a 由本室保藏，克隆载 体PMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司，酿酒酵母( Saccharomyces cerevisia®菌株INVScI和表达 载体 pYES3/CT 购自 Invitrogen 公司。1.2 试剂所用 DNA 限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司， DNA 分子量标准和高保真 DNA

17、 聚合酶 购自北京全式金生物技术有限公司产品，细胞总 RNA 提取和反转录试剂盒购自 Promega 公司，脂肪酸甲 酯标准品购自 Sigma 公司。1.3 ?12- 脂肪酸脱氢酶基因的克隆从培养48h的粘红酵母YM25079中提取提取总 RNA，按反转录试剂盒说明书取 1 总RNA为模板进行反转录合成第一条cDNA，冻存于-20 C备用。同时，基于已获得的部分序列的相似性搜索结果，以NCBI Genbank 中粘红酵母（Rhodotorula glutinis ）菌株 ATCC204091、圆红冬抱酵母（ Rhodosporidium toruloides）菌株NP 11潜在的？12-脂肪酸

18、脱氢酶基因序列作为参考，设计合成引物对进行PCR扩增，上游弓I物为：5'-ATAAGCTTATGGCCGCTACCCTCCGCCAGC-3' （下戈卩线部分为 Hind III位点），下游弓I物为RDD12R : 5'-ATGAATTCCTAGAGTCCCTCGACGCCCGAGT-3 '（下戈卩线部分为 EcoR I 酶切位点）。PCR 扩增条件为：94C 变性 2 min,然后按 94 C 1 min，56 C 1 min，72C 2 min，30 个循环，最后 72°c 10 min。将PCR产物回收并克隆到 PMD18-T载体上，转化大肠杆菌D

19、Ha，蓝白斑筛选和菌落 PCR鉴定阳性克隆， 挑取正确的阳性克隆进行测序。1.4 ?12-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达1.4.1 表达质粒PYRGD12勺构建将PCR产物和表达载体分别用 Hind III和EcoR I双酶切、回收、连接并转化大肠杆菌 DHa。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、载体构建和转化、重组质粒的鉴定均按常 规方法进行，所得重组质粒命名为pYRGD12。1.4.2 酿酒酵母细胞的转化和诱导表达按文献12的方法，通过 LiAc方法将pYRGD12和空载体PYES3/CT分别转化感受态的酿酒酵母INVScl菌株，28C培养72h后挑取SC-Ura （无尿嘧啶）选择培养基平

20、板上生长的转基因酵母，接种于5 ml SC-Ura选择性液体培养基中（含 2%的棉籽糖或葡萄糖）,28C过夜培养；以5%的接种量加入含有 1% NP-40、2%棉子糖的100 ml SC-Ura培养基，28C继续培养，等酵母 细胞的密度达到 OD=0.20.3时加入2%半乳糖诱导，再转入20C培养72 h，然后2500rpm收集菌体，用去 离子水洗涤三次，50 C烘干，研碎。1.5 脂肪酸气象色谱分析用8 mlNa2S2O8,GC参照文献11啲方法，取100 mg干菌粉加入5 ml 5%的KOH-CH3OH溶液中，70 C反应3-5 h。冷却到 室温后，用6 mol/L的盐酸调节溶液的 pH值

21、为2.0,加入4 ml 14% BF3 （ BF3/乙醚）-CH3OH溶液，70 °C 继续反应1.5 h，合成脂肪酸甲酯。再加入饱和的NaCI溶液10 ml，充分混匀后转移到分液漏斗中。1:4的氯仿：己烷抽提两次，合并提取液，然后加入适量无水Na2S2O8干燥提取液，静置1 h,过滤去除 用氮气将含有脂肪酸甲酯的滤液吹干，然后用正己烷回溶，最后以亚油酸甲酯标准品最为对照，进行 分析，测定PYRGD12转基因酵母中LA的合成。2结果2.1全长cDNA序列扩增bp200050025010010007501 2图1粘红酵母YM25079小2-脂肪酸脱氢酶基因的 PCR扩增°1：

22、DNA分子量标记DL2000；2: PCR扩增产物。12Fig.1 PCR amplification of Rhodotorula glutinis YM25079 ? -desaurase gene.1：DNAMarker DL2000; 2 PCR p roduct以总RNA反转录产物作为模板，利用参考 NCBI Genbank中粘红酵母ATCC204091和圆红冬抱酵母NP11 潜在的？12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计的引物进行 PCR扩增，获得大小为1.4kb的片段（图1）。将片段进行 回收，连接到PMD18-T载体上并转化大肠杆菌 DH5 a,经蓝白斑筛选和菌落 PCR验证，挑取正确

23、的阳性克隆送出测序。ATGGCCGCTACCCTCCGCCAGCGCACCGCCGCCGCCGCGCCCCGCAAGGAGAAGGAGCACGACGTCCTCGCGM A A T L R Q R T A A A A P R K E K E H D V L A73TCGTCCGACTCGGAGGAGGAGCACCAGGACCCGCTCAAGGCGCTCGAGAACGAGTACCCGCCGTTCGTCGTG25S S D S E E E H Q D P L K A L E N E Y P P F V V145CCCAACCTCACCATCAAGGAGGTCCTCGGCGCCATCCCGGCCAAG

24、TGCTTCGAGCGCTCGGCCCTGCGCTCG49P N L T I K E V L G A I P A K C F E R S A L R S217TCGACCTACGTCGTCGGCGACTTCCTCATGGTCGCTGCCCTCGGCTATGCCGCGTACCACATCGACCCGGCC73S T Y V V G D F L M V A A L G Y A A Y H I D P A289TTCTCGTACACGGGCGGCAAGCACCTCGACGGCTGGGCCGGGTTCGCCGCCAAGTGGGCCGCCTGGAGCCTG97F S Y T G G K H L D G W

25、 A G F A A K W A A W S L361TACTGGACCCTCCAGGGCTGGGTCATGACCGGCATCTGGATCCTCGGTCACGAGTGCGGCCACCAGGCGTTC121Y W T L Q G W V M T G I W I L G H E C G H Q A F433TCGACGTCCAAGACGATCAACAACACGATGGGCCTGTTCCTCCACTCGTTCGTCCTCGTGCCGTATCACTCG145S T S K T I N N T M G L F L H S F V L V P Y H S505TGGCGCATCTCGCACGCCAAGCA

26、CCACGCCGCCACCGGTCACCTCACGCGCGATGAGGTGTTCGTGCCCCGC169W R I S H A K H H A A T G H L T R D E V F V P R577ACCAAGTCGACCCGCAACCCCAAGCCGACGGGCAAGAAGCTCGAGGTGTCGCGCAACGTCGAGATCGACGAG193T K S T R N P K P T G K K L E V S R N V E I D E649CTCCTCGAGGACGCGCCCGTGTACCGCCTCGGGTGGATCCTCGTCCAGCAGCTGTTCGGCTGGCCCGCCTAC2

27、17L L E D A P V Y R L G W I L V Q Q L F G W P A Y721CTGTTCACCAACGCGTCCGGCCAGCTGTGGTACCCCAAGTGGACCAACCACTTCGACCCGTCGTCGCTCGTG241L F T N A S G Q L W Y P K W T N H F D P S S L V793TTCGACGCCCGCCACCGCAACCAGGTCCTCATCTCGGACGCGTTCCTCGTCGGCATGGTCGGCCTCCTCACC265F D A R H R N Q V L I S D A F L V G M V G L L T8

28、65CTGTTCGGCTCGGTCATGGGCGGCTTCTCGGCCGTCACCAAGTACTACCTCGTGCCGTACCTCCTCGTCAAC289L F G S V M G G F S A V T K Y Y L V P Y L L V N937CACTGGCTCGTCATGATCACGTACCTCCAGCACACGGACCCTCAGCTGCCGCACTACTCGGCCGACATGTGG313H W L V M I T Y L Q H T D P Q L P H Y S A D M W1009AACTTCCAGCGCGGCGCCCTGTGCACCATCGACCGCAACCTCCTCGG

29、TCCCGTCGGCCCGTACCTCATGCAC337N F Q R G A L C T I D R N L L G P V G P Y L M H1081GGCATCACCGAGACGCACGTCGCCCATCACATCTCGTCCAAGATCCCGCACTACCACGCCTGGGAGGCGACC361G I T E T H V A H H I S S K I P H Y H A W E A T1153GAGGCGCTCAAGTCGTTCCTCGGCGAGCACTACCACGCGACCGACGAGAACATGTTCGTCTCGCTGTGGAAG385E A L K S F L G E H

30、Y H A T D E N M F V S L W K1225GGCTACAAGCAGTGCCGCTACGTCGAGGACGAGGGCCCCGTCCTGTTCTACAAGGACGCGTACGGTCGCGCT409G Y K Q C R Y V E D E G P V L F Y K D A Y G R A1297CGCCGCAACTACGTCCTCCCCGACGTTCCCTCCGACTCGGGCGTCGAGGGACTCTAG433R R N Y V L P D V P S D S G V E G L *图2 YM25079 A'2-脂肪酸脱氢酶基因序列及其编码的氨基酸序列。灰色背景表示

31、三个组氨酸保守区。12Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of YM25079 A -desaurasegene. Gray backgroundsin dicate the three con served histid in e-rich motifsYM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12LENEYPPF LENEYPPF LENEYPPF KP AFERNIIL49515135YM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12NL

32、T NYS NYSEFTPAFSYT PAF SF D PAF SF D KFEN PL10010210286YM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12GGKILDGWIGFAAKWII ggkilsgwigfaakwil ggkilsgwigfaakwilI RYLA151153153125YM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12KPKPKPPK201203203176YM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12TGKKLEl TGKKLR TGRK

33、LR eniaaa252254254226YM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12K K K RDPS DPS DPS itihrniil I hrgiil hrgiil I NFFDI I ILLLafligm AFLAGM AFLAGMI lgiliil303304304276tlfgsimggfs iafgiii. gli iafgiii. gli I iasmil. slltYM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12IL vpY|L|NH WHMIT Y|QIIDPQ|s ad HFIRG

34、IICI i Unlligp FI .fVniwlimuiIiiisIInagMiniiigihimirnml 中 FI .fVNIWLIMHiIIDIsHnagMINIIRGAIIIi Hnml 中 I i|f|fwlil.fLI|D|k|regaH|RGIIIIHsf.服i i i F354355355326YM25235RGD12ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12GPYLMHTETHI SIKI H|AEISF|H|HATDENMFIs gpylmHceTIIlsIki I|IAeinf|nytdegmfrs GPYLm|IIce|I|LsIkI IHII

35、IWAIeiIInfIIInITDEpmfls L DHMf|h|Hlf|qM|f|e|A|klHEY|iYDPSpi IIA405406406377IM25235RGD12 |ATCC204091RGD12NP11RTD12IS-4MAD12HIkgikIkayrIkayr|rsfreC|F|e|ikdaygrarrniilpdipsdsgieg irdaygrarriaipaeipsdsgieg irdaygrarriaipaeipsdsgieg FKK449450450399miitlrirtaaa. aprkekeidil|ssdseeeiidpl . miitlririaaiptas

36、kekehdilIssdsedehnqdpl miitlririaaipaprkekehdil|ssdsedehnidP I mippntid|gl tirhi stsap黑色表示相同氨基酸，下划线表示三个组图3推测的粘红酵母 YM25079?12-脂肪酸脱氢酶和粘红酵母(ATCC204091RGD12)、圆红冬抱酵母(NP11RTD12) 和高山被抱霉IS-4(IS-4MAD12)的孑12-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列序列比对。氨酸保守区。12 12Fig.3 Sequence alignment of deduced amino acids of the Rhodotorula glutini

37、s ? -desaurase with the ? -desaurase ofRhodotorula glutinis (ATCC204091RGD12), Rhodos poridium toruloides (N P11RTD12) and Mortierella al pine (IS-4MAD12). Black backgrounds indicate identity of amino acid residues. The three conserved histidine-rich motifs are underlined.2.2序列分析测序结果表明，PCR扩增获得1353bp

38、的cDNA序列，编码450个氨基酸(图2)。将所推测的氨基酸序列和已知真菌的 A6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列进行比较，结果显示氨基酸序列具有膜整合酶特异性的组氨 酸保守区HECGH （HisI区，氨基酸位点3741 ）、HAKHH （ HisII区，氨基酸位点7377）和HAVHH （HisIII 区，氨基酸位点366-370）（图2、3），该序列编码的氨基酸序列与未经功能验证的圆红冬抱酵母NP11 A12-脂肪酸脱氢酶（Genbank编号EMS18237 ）和粘红酵母 ATCC204091 A12-脂肪酸脱氢酶（Genbank编号 EGU10893）的相同性（Identity ）最高，分别为8

39、3.63%和83.41%，但是与已报道的 A12-脂肪酸脱氢酶相似 性最高为深黄被抱霉IS-4的A12-脂肪酸脱氢酶4 （Genbank编号AAF08684 ），相同性为42.79%，表明所获 得的cDNA序列为一个新的潜在 A12-脂肪酸脱氢酶基因。2.3重组表达质粒 PY3RGD12勺构建把目的基因连接到表达载体pYES3/CT上构建重组质粒 PY3RGD12 （图4A），经菌落PCR验证后提取重组质粒，用Hind III和EcoR I进行双酶切分析，结果表明重组质粒酶切产生 1.4kb和5.9kb的两条带 （图4B第3泳道），两条带分别与目的基因片段和空载体酶切后的大小一致，初步表明构建

40、成功，同时将 酶切验证正确的质粒送出进一步进行测序验证。AmpicillineoobpSOO15001DOO500030002000234A300图4重组质粒PY3RGD12的构建。a :重组质粒pY3RGD12质粒图谱；B :重组质粒pY3RGD12限制性酶切分析，1 :DNA 分子量标准 DL5000, 2: PCR 产物，3： Hi nd III 和 EcoR I 双酶切 pY3RGD12，4： Hi nd III 和 EcoR I 双酶切 p YES3/CT。Fig.4 Construction of recombinant pl asmid pY3RGD12. A: Map of R

41、ecombinant p lasmid pY3RGD12; B: Restrictive analysis of pY3RGD12, 1:DNA marker DL5000, 2: PCR p roduct, 3: pY3RGD12 digested by Hi nd III and EcoR I, 4: p YES3/CT digested by HindIII and EcoR I.2.4粘红酵母YM25079?12-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的诱导表达表1不同质粒转化的酿酒酵母脂肪酸含量Tab.1 Fatty acid comp osition of total li pid from

42、 yeast transformants containing p YES3/CT and p YESRGD12Fatty acid comp osition(%)TransformantC14:0C16:0C16:1C18:0C18:1 OAC18: 2 LAP YES3/CT0.7921.5733.539.7133.740P Y3RGD120.6220.9833.598.9530.274.31将经验证正确的重组质粒转入酿酒酵母INVScl中进行功能表达，经半乳糖诱导，提取细胞总脂肪酸并进行甲酯化，以亚油酸甲酯标准品、空载体PYES3/CT转化的酵母菌INVScl作为对照进行GC分析，转化空

43、载体对受体菌株INVScl的脂肪酸组成和含量没有影响，因此通常用来做阴性对照。如图5B所示，只有转化了 PY3RGD12的酵母工程菌株中产生保留时间为13.8 min的特殊峰（黑色箭头所示），含量占总脂肪酸的5A）中没有出现相应的峰，对该新4.31% （表1），与亚油酸甲酯标准品的保留时间一致，而在对照样（图峰的质谱分析结果也证明其为亚油酸甲酯。这些结果表明扩增获得的目的基因所编码的酶具有？ 12-脂肪酸脱氢酶的活性，能利用内源性油酸作为底物合成亚油酸。eonong&K roLGcleD7,51012.5I15 minpgsesnonseR ro-celeDmg1012.515 min

44、图5转基因酿酒酵母总脂肪酸的气相色谱分析图。A : PYES3/CT转化的酵母；B : pY3RGD12转化的酵母。Fig 5 GC analysis of fatty acids in transgenic Saccharomyces cerevisiae. A： Saccharomycescerevisiae transformed with pYES3/CT; B: Saccharomyces cerevisiaetransformed with pY3RGD12.3讨论脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturase)催化脂肪酸链上特定的位点脱氢形成双键，在生物体内对脂肪酸代谢

45、、维持膜的正确结构和生物学功能方面起着重要的作用5,13o脂肪酸脱氢酶一般具有特征性的3个保守的组氨酸富集区His I (HXXXH 八 His II ( HXXHH )和His III ( HXXHH ) 14，除了植物质体中？9-脂肪酸脱 氢酶是可溶性的外，其余都是膜结合的脂肪酸脱氢酶，其中微体膜脂肪酸脱氢酶按其引入双键的方式不同又可以分为两种，一种是甲基定向的脂肪酸脱氢酶，催化已有的双键和甲基之间形成另一个双键，另一种 是羧基定向的脂肪酸脱氢酶 , 催化已有的双键和羧基之间形成另一个双键，而且 N 端还有一个类似于细胞 色素b5(Cyt b5)的血红素结合区HPGG 5,13。氨基酸序列

46、分析显示，我们获得的cDNA编码的氨基酸序列中具有三个典型的组氨酸保守区 HECGH( HisI 区，氨基酸位点 3741)、HAKHH( HisII 区，氨基酸位点 7377) 和 HAVHH(HisIII 区，氨基酸位点 366-370)，分布位点以及保守区之间氨基酸数目均和已知的?12-脂肪酸脱氢酶类似，而且 N 端也没有类似于细胞色素 b5 的血红素结合区 HPGG 序列存在(图 2、3)，因此该氨 基酸序列属于甲基端定向的脂肪酸脱氢酶， NCBI 相似性搜索结果也表明与酵母和丝状真菌的?12-脂肪酸脱氢酶的相似性最高，初步表明该 cDNA 序列为一个新的潜在的 ?12-脂肪酸脱氢酶基

47、因。?12-脂肪酸脱氢酶属于膜整合蛋白，和其它大多膜蛋白一样，目前还没有该酶的分离纯化和体外活性 分析的报道，因此脱氢酶的活性只能通过检测脂肪酸组成变化来测定。为了验证所获得基因的功能，我们 将其转入酿酒酵母中， 结果证明该基因编码产物将内源性油酸转化成亚油酸(图5)，因此我们获得 cDNA序列是一个新的 ?12-脂肪酸脱氢酶基因。此外，近年来对一些真菌和原生动物来源的?12-脂肪酸脱氢酶基因体外功能验证表明，该酶具有多功能特点8,9,100粘红酵母YM25079能合成亚油酸和 a-亚麻酸(alinoleicacid)，表明其具有 A12和欠5-脂肪酸脱氢酶，但是在我们前期尝试分离独立的勺5-

48、脂肪酸脱氢酶基因，一直没有取得进展，因此本研究所获得的基因编码的蛋白是否也具有双功能的'/15-脂肪酸脱氢酶活性将有待于进一步分析0由于脂肪酸脱氢酶可以用于微生物代谢工程进行工业化生产 PUFAs 和其它有价值的不饱和脂肪酸， 极大促进了对真菌来源的脂肪酸脱氢酶的研究g。一些产油酵母(Oily yeasts)能在细胞累积油脂占其干重的 20%，在已发现的酵母中大约 5%的种类能累积 25%以上细胞油脂，包括亚罗酵母属( Yarrowia ) , 假丝 酵母属(Candida),红酵母属(Rhodotorula),红冬抱酵母属(Rhodos poridium),隐球酵母属(Cryp to

49、coccus)， 毛抱子菌属(Trichosporon )和油脂酵母属(Lipomyces)等一些菌株16。产油酵母中油脂的成分与常见的 植物油相类似， 油脂的生物化学和物理化学性质独特明确， 作为商业化膳食性 PUFAs 的来源以及生物柴油 原料的开发和研究已逐渐成为研究的热点，而且近十年来越来越多的研究集中于酵母油脂合成生化途径的 阐明上 17。因此，本研究以筛选自泸沽湖水的一株产油酵母粘红酵母 YM25079 作为研究对象， 对其 PUFAs 合成相关基因进行分离鉴定，有助于丰富脂肪酸脱氢酶基因资源，阐明YM25079 中 PUFAs 合成的相关生化途径，为进一步利用粘红酵母或者相关基因

50、生产特定的 PUFAs 打下基础。此外，虽然通过基因组解析从 一株粘红酵母 ATCC204091 也发现一潜在的 ?12-脂肪酸脱氢酶基因序列 18，但是该序列和本研究获得全序 列并不相同，而且目前也未见从不同粘红酵母中克隆表达?12-脂肪酸脱氢酶基因的研究报道。粘红酵母YM25079?12-脂肪酸脱氢酶基因已上载到NCBI Genbank，序列编号为 KJ502672。参考文献 References.5.6.张琦, 王志, 何仕武, 季秀玲, 林连兵, 魏云林. 多不饱和脂肪酸对微生物低温适应性的影响 J. 生命科学. 2012, 24(1):58-63. Zhang Q, W

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