铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其耐药表型与外膜蛋白

1、铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其耐药表型与外膜蛋白OprD2的关系         09-08-27 11:43:00     编辑：studa20          作者：刘永芳 吕晓菊* 俞汝佳 宗志勇 高燕渝 陈慧莉 李晓芳 蒋胜 韩乾国【摘要】  目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)临床分离株对几种常用抗铜绿假单胞菌药物

2、的敏感性；探索铜绿假单胞菌临床分离株对亚胺培南和美罗培南耐药性差异与其膜孔蛋白OprD2变化的关系。方法 琼脂对倍稀释法测定142株Pa对亚胺培南、美罗培南等8种常用抗假单胞菌药物的最低抑菌浓度，从中筛出32株对亚胺培南和美罗培南不同耐药表型的Pa，提取外膜蛋白并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离，检测OprD2相对含量。结果 耐药率最高的是亚胺培南(54.23%)，其次是环丙沙星(45.07%)、美罗培南(28.87%)、氨曲南(19.72%)、阿米卡星(17.61%)、哌拉西林/三唑巴坦(14.08%)和头孢他啶(11.97%)，头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(9

3、.86%)。呈现多重耐药的菌株占38.73%(55/142)，交叉耐药率高达40.84%(58/142)。在对亚胺培南耐药的菌株中，合并有其他-内酰胺类抗生素耐药的菌株达到62.34%(48/77)。32株Pa外膜蛋白电泳结果显示OprD2相对含量在耐药组为03.5%(其中有一株为8.70%)，敏感组为6.20%10.20%。在碳青霉烯类耐药组与敏感组之间统计分析P<0.05，耐碳青霉烯类组低于敏感组，但是在亚胺培南耐药、美罗培南敏感组与亚胺培南、美罗培南均耐药组之间差异无统计学意义。结论 铜绿假单胞菌耐药菌株常见，且常呈多重耐药和交叉耐药。亚胺培南耐药率高于美罗培南。膜孔蛋白OprD2

4、减少或缺失是我院Pa对亚胺培南耐药的主要原因之一。但在美罗培南耐药中所起的作用，有待进一步研究。 【关键词】  铜绿假单胞菌； MIC； 耐药性； 亚胺培南； 美罗培南； OprD2    ABSTRACT  Objective  To study the activities of some commonly used antibiotics against Pseudomonas aeruginosa, investigate the correlation between the resistance phenotypes an

5、d the amounts of outer membrane protein (OpD2) of P.aeruginosa, and discuss the mechanism of different resistant phenotypes in P.aeruginosa.  Methods  The minimal inhibitory concentrations (MICs) of 8 antimicrobial agents against 142 clinical isolates were determined by agar dilution metho

6、d. Membrane proteins of 32 strains with different resistant phenotypes to imipenem and meropenem were obtained by SDS-PAGE electrophoresis method and the relative amounts of OprD2 were determined.  Results  The resistant rate of imipenem was the highest (54.23%), followed by ciprofloxacin

7、(45.07%), meropenem (28.87%), aztreonam (19.72%), amikacin (17.61%), piperacillin/tazobactam (14.08%), ceftazidime (11.97%) and cefoperazone/sulbactam (9.86%). The cross resistance rate to -lactams was 40.84% (58/142), multi-drug resistance rate was 38.73% (55/142). It accounted for 62.34% (48/77),

8、resistant to the other -lactams in all isolates resistant to imipenem. Membrane proteins of 32 strains were isolated and determined by SDS-PAGE electrophoresis method. Result showed that the relative amounts of OprD2 ranged from 0 to 3.5% in strains resistant to carbapenems (except   

9、 a strain which OprD2 was 8.70%); others were from 6.20% to 10.20% in susceptible strains. The statistic results showed the relative amounts of OprD2 of 27 strains resistant to carbapenems were much than susceptible strains.  Conclusions  P.aeruginosa was frequently resistant to clinical a

10、ntimicrobial agents, the most were cross resistant and multi-drug resistant strains. Resistance rate of imipenem was higher than that of meropenem. The loss or diminishment of OprD2 was the main reason for the imipenem resistance of P.aeruginosa in our hospital, but its effect on meropenem resistanc

11、e deserved further study.    KEY WORDS  Pseudomonas aeruginosa;  MIC;  Resistance;  Imipenem;  Meropenem;  OprD2    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是临床上常见的引起严重医院感染的条件致病菌之一，大量研究显示Pa对碳青霉烯类抗生素的耐药率日渐上升。许多学者认为仅有OprD2蛋白减少或缺失，Pa可对亚胺培南耐药而对美罗培南无影响，

12、但此结果多数为试验诱导菌株的研究，用于临床株研究的尚少。本研究调查了142株非重复临床Pa菌株对8种常用抗生素的敏感性、科室分布及标本来源情况；从中筛出32株对亚胺培南和美罗培南不同耐药表型的Pa，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离外膜蛋白，并检测OprD2相对含量，探索临床Pa分离株对亚胺培南和美罗培南耐药性差异与其膜孔蛋白OprD2之间的关系。    1  材料和方法    1.1  抗生素敏感性试验    (1)试验菌株  2005年1月2

13、005年7月四川大学华西医院临床标本中分离到的142株非重复铜绿假单胞菌行体外药物敏感试验，经Microscan Walkaway-40型全自动细菌鉴定仪鉴定。    质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853由四川大学华西医院感染病中心抗感染药物研究室提供；PAO1为铜绿假单胞菌的野生标准株由四川大学华西医学院基础学院微生物室提供。    (2)药品、试剂和仪器  头孢他啶(AZ)、阿米卡星(AMK)、头孢哌酮(CPZ)、哌拉西林(PIPC)、环丙沙星(CPLX)、舒巴坦(SB)和三唑巴坦(TB)均为标准品，购自中国药品生物制

14、品检定所；氨曲南(AZ)为中美上海施贵宝制药有限公司产品；亚胺培南(IMP)为杭州默沙东制药有限公司产品；美罗培南(MRP)为深圳市海滨制药有限公司产品；CCCP和PAN购自Sigma公司。    培养基为水解酪蛋白(MH)琼脂，购自杭州天和微生物试剂有限公司。    A-400型多点接种仪，英国Denley Instruments有限公司；细菌比浊仪，法国Bio-Merieux公司。    (3)试验方法  琼脂平皿对倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。按照美国国家临床试验室标准研究所(CLS

15、I/NCCLS)推荐方法测定亚胺培南、美罗培南、氨曲南、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、环丙沙星和阿米卡星对142株Pa的MIC值。    (4)统计方法  统计软件为SPSS 13.0，2检验法分析亚胺培南和美罗培南耐药率之间统计学意义。    1.2  外膜蛋白OprD2的检测    (1)试验菌株  从药敏结果筛选出30株不同耐药表型的Pa，分成三组：第一组为对亚胺培南及美罗培南均敏感的菌株，共3株；第二组为对亚胺培南耐药、对美罗培南敏感的菌株，共10株

16、；第三组为对亚胺培南及美罗培南均耐药的菌株，共17株。另有2株(铜绿假单胞菌ATCC27853和PAO1)对亚胺培南及美罗培南均敏感的菌株，归为第一组。    (2)试剂和仪器  十二烷基肌氨酸钠和十二烷基磺酸钠(SDS)购自Sigma公司；LB肉汤为宜兴市永信生物有限公司产品；Tris由上海Sangong有限公司生产；丙烯酰胺为Merck公司产品；亚甲基双丙烯酰胺为Gincobrl公司产品；甘氨酸和四甲基乙二胺(TEMED)为德国Fluka公司产品；蛋白质分子量Marker购自Fermentas公司。超声细胞破碎仪由美国Sonicsmaterials公

17、司生产；高速冷冻离心机产自德国Heraeus公司；凝胶成像系统为美国BIO-RAD公司产品；紫外分光光度计产自Beckman公司；垂直电泳仪美国BIO-RAD公司产品。    (3)试验方法    外膜蛋白的制备  参考国外文献报道方法1制备外膜蛋白，具体步骤如下：25%甘油肉汤保存的菌株在MH琼脂平皿上复苏16h；挑取单个菌落接种于20ml LB肉汤中，于37摇床上震荡培养约16h至对数生长期，然后转种至250ml LB肉汤中，37振荡培养20h；培养液4离心(7000r/min，10min)，沉淀菌液用10ml PB缓冲

18、液(10mmol/L，pH7.0)洗涤两次并用10ml同样缓冲液混悬细菌；细菌悬液置冰浴超声破碎细菌4min(每次10s，间隔5s)；4离心(5000r/min，15min)，弃未破碎细胞，取上清液4离心(12000r/min，60min)，弃上清液，将沉淀悬浮于10mmol/L pH7.0PB缓冲液中(内含2%十二烷基肌氨酸钠)，室温作用30min；悬液室温离心(12000r/min×30min)，弃上清夜，并用1%十二烷基肌氨酸钠洗涤2次，提纯后的外膜蛋白悬浮于10mmol/L pH7.0PB缓冲液中；紫外吸收法测定蛋白含量。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.45A280-A260测定蛋白浓度，调节蛋白浓度至20g/l，蛋白样品置-70保存备用。