清华共聚焦讲解_图文

1、OCM 齐冬 2008/5 激光扫描共聚焦显微镜讲解 Olympus 齐冬 2009,05 荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜原理 基本原理 Zoom成像 成像 扫描速度 3D成像 成像 多通道和光谱 时间相关成像 光操作 AOTF SIM 1 OCM 齐冬 2008/5 荧光原理 高能级、不稳态 Stokes频移 能级 照明光 (激发光 荧光 (发射光 低能级、稳态 荧光物质，探针、 染料、蛋白. 荧光的激发和发射光波段都在一定范围内 UV Violet <400nm 400nm Blue 460nm Cyan 480nm Green 530nm Yellow Orange 560nm 5

2、80nm Red 630nm Near IR >700nm 350nm 400nm 500nm 600nm 700nm 2 OCM 齐冬 2008/5 荧光显微镜 OCM 齐冬 2008/5 6 3 OCM 齐冬 2008/5 B 阻挡 B 透过 ，C B ，C 透过 B B C nm T% A 反射 A 透过 A1 ，A 透过 ，A nm A nm A A1 多通滤色镜 BS20/80 405/488/559/635 4 OCM 齐冬 2008/5 激发光命名： WU/WIB/NIBA/WIG 荧光染料命名 GFP/YFP 激光器 激光器 405 多线氩离子 559/543 635 适

3、合染料或荧光蛋白 DAPI、H33258、BFP （CFP） 、 、 ） GFP、FITC、Fluo3、Alexa fluo488 、 、 、 ）、YFP （CFP）、 ）、 CY3、TRITC、TMR、MT、DsRed 、 、 、 、 CY5、Texas Red、A647 、 、 10 5 OCM 齐冬 2008/5 荧光的衰减 有衰减的标本 防衰减的方法 经常使用光闸 降低激发光强度 使用抗衰减剂 选择衰减小的荧光素 降低标本中氧的浓度 光闸的运用 6 OCM 齐冬 2008/5 荧光显微镜的问题？ 荧光显微镜的问题？ OCM 齐冬 2008/5 13 眼睛观察 CCD 取图 14 7 O

4、CM 齐冬 2008/5 荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜原理 基本原理 Zoom成像 成像 扫描速度 3D成像 成像 多通道和光谱 时间相关成像 光操作 AOTF SIM 15 生物用激光共焦扫描显微镜主要是对 _显微观察方法的改进？ 显微观察方法的改进？ 荧光 显微观察方法的改进 主要应用是： 主要应用是：生物荧光相关研究领域 几乎含盖整个生物领域的 少量定位、半定量、定时、 少量定位、半定量、定时、定性相关的研究 流式细胞仪） （大量定量流式细胞仪） 大量定量 流式细胞仪 16 8 OCM 齐冬 2008/5 Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM

5、 Confocal vs C-CCD C-CCD camera 细胞标本 Confocal OCM 齐冬 2008/5 17 共聚焦原理 共聚焦针孔 Pinhole (Pinhole 光电倍增管 (PMT 发射光滤色片 荧光滤光片 (发射光滤色片 激光 物镜 标本 9 OCM 齐冬 2008/5 眼睛观察 CCD 取图 Confocal 图像 宽场照明显微镜和共聚焦图像比较 OCM 齐冬 2008/5 20 10 OCM 齐冬 2008/5 可调的针孔（ 可调的针孔（C.A. Pinhole 针孔尺寸 图像分辨率 Z轴光学切片 图像反差 图像亮度 实际应用中的建议： 实际应用中的建议： 开大针

6、孔，获得更明亮的图像、更好的图像反差，有效保护标本， 开大针孔，获得更明亮的图像、更好的图像反差，有效保护标本，适合薄标 本或活细胞， 本或活细胞，低ZOOM 关小针孔，获得更好的光切效果、更好的细节，适合较厚标本， 关小针孔，获得更好的光切效果、更好的细节，适合较厚标本，高ZOOM 21 增大 低 厚 高 高 减小 高 薄 低 低 眼睛观察 CCD 取图 Confocal 图像 图像？ 图像？ 22 11 OCM 齐冬 2008/5 Confocal Laser Scanning Microscope X线上的荧光强度变化 线上的荧 多条线构成2维图像 23 荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜原

7、理 基本原理 Zoom成像 成像 扫描速度 3D成像 成像 多通道和光谱 时间相关成像 光操作 AOTF SIM 24 12 OCM 齐冬 2008/5 可以局部扫描ZOOM功能 -充分利用物镜分辨率：数值孔径NA 充分利用物镜分辨率： OCM 齐冬 2008/5 25 OCM 齐冬 ZOOM ZOOM和高分辨率 和高分辨率 扫描的极限是？ 扫描的极限是？ 26 13 OCM 齐冬 2008/5 ZOOM的极限是？ 的极限是？ 的极限是 物镜最重要的参数不是倍率！ 物镜最重要的参数不是倍率！ NA！ ！ 色差校正！ 色差校正！ 27 FN18 60X NA1.4 FITC (550nm 全视野

8、扫描最高需要分辨率？ 全视野扫描最高需要分辨率？ 2x18x 2X1.4x1000 60x2 x0.55 2x实际视场边长 实际视场边长 = 物镜分辨率 /2NA 物镜分辨率( = 2160 2X 是Nquist取样频率； 取样频率； 取样频率 1000是单位换算 是单位换算 28 14 OCM 齐冬 2008/5 扫描分辨率 40X NA1.3 ZOOM1X 512X512 29 40X NA1.3 ZOOM2X 512X512 扫描分辨率 40X NA1.3 ZOOM4X 512X512 40X NA1.3 ZOOM10X 512X512 30 15 31扫描分辨率40X NA1.3 ZO

9、OM4X 512X51240X NA1.3 ZOOM10X 512X51232扫描分辨率40X NA1.3 ZOOM20X 512X51240X NA1.3 ZOOM50X 512X51233荧光基础激光扫描共聚焦显微镜原理基本原理Zoom 成像扫描速度3D 成像多通道和光谱时间相关成像光操作AOTF SIM34扫描速度每一点停留的时间 us/p 扫描速度和成像质量的平衡速度越慢成像质量越高速度快增加激光强度-标本杀伤增加PMT 电压-噪音光漂白光漂白、毒性等35扫描速度1 S/F2 S/F36扫描速度1 S/F 7 S/F37荧光基础激光扫描共聚焦显微镜原理基本原理Zoom成像扫描速度3D成

10、像多通道和光谱时间相关成像光操作AOTFSIM3839从2D 2D到到3D 3D?40三维重建和切割XYXZYZOCM 齐冬 2008/5 去 初 非 焦 信 息 的 三 维 重 建 from PC Cheng 41 80um） 脑缺氧（80um） 42 21 OCM 齐冬 2008/5 XYZ重建和测量 重建和测量 OCM 齐冬 2008/5 Z轴光切 轴光切 步进多少？ 步进多少？ 物镜 波长 pinhole 44 22 OCM 齐冬 2008/5 荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜原理 基本原理 Zoom成像 成像 扫描速度 3D成像 成像 多通道和光谱 时间相关成像 光操作 AOTF SI

11、M 45 多通道荧光同步采集 激光 TRITC PMT FITC PC 显微镜 DAPI pinhole OCM 齐冬 2008/5 46 23 OCM 齐冬 2008/5 PMT offset越高图像背低 越高图 越高 约黑，但图像信息也 可能会被扣除掉 PMT电压越高图像 电压越高 电压越高图 越明亮， 越明亮，但图像噪音 会越来越明显 会越来越明显 47 48 24 OCM 齐冬 2008/5 第三脑室 视丘下部 49 大脑皮层 丘脑 多通道荧光同时采集 分别调节灰度、 分别调节灰度、反差和颜色 LUT 50 25 OCM 齐冬 2008/5 LUT Ctrl +H 51 Rainbow

12、 mouse 52 Livet et al. Nature 1st Nov 2007 26 OCM 齐冬 2008/5 染料串色及消除 DAPI OCM 齐冬 2008/5 GFP DAPI OCM 齐冬 2008/5 GFP 27 OCM 齐冬 2008/5 DAPI OCM 齐冬 2008/5 GFP 序列扫描 OCM 齐冬 2008/5 56 28 OCM 齐冬 2008/5 DAPI OCM 齐冬 2008/5 GFP 光谱型共聚焦的应用 OCM 齐冬 2008/5 58 29 OCM 齐冬 2008/5 准确、 准确、精确的光栅光谱系统 光栅快速旋转-线性光谱扫描 光栅快速旋转-线性

13、光谱扫描 -800 快速切换： 快速切换：100nm/ms 高精确： 高精确： 1nm步进 步进 荧光染料： 荧光染料：任意选择波段和带宽 800 400 400 OCM 齐冬 2008/5 473nm 485nm 497nm 509nm 59 800 蓝 （宽） 空 蓝 （窄） 400 绿 反光镜 （宽） 绿 （窄） 采集荧光随意选择 带宽随意调整 可以获取标本光谱信息 更高的透过率 更快速的切换 60 OCM 齐冬 2008/5 30 OCM 齐冬 2008/5 应用1 应用 光栅 光栅狭缝 随意可调滤色片 无限染料应用 OCM 齐冬 2008/5 61 光谱拆分 （Unmixing） ）

14、 FITC （细胞膜） FITC （细胞膜） GFP（细 胞质内） GFP（细 胞质内） 62 OCM 齐冬 2008/5 生物物理所 31 OCM 齐冬 2008/5 来自美国北卡大学 OCM 齐冬 2008/5 63 Olympus FV1000S 荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜原理 基本原理 Zoom成像 成像 扫描速度 3D成像 成像 多通道和光谱 时间相关成像 光操作 AOTF SIM 64 32 OCM 齐冬 2008/5 一般的延时摄影Time Lapse OCM 齐冬 2008/5 囊泡运输 OCM 齐冬 2008/5 33 OCM 齐冬 2008/5 高速的离子成像 OCM

15、齐冬 2008/5 线扫描功能快速采集信号 Ca 2+火花 OCM 齐冬 2008/5 50mS 68 34 OCM 齐冬 2008/5 长期观察的系统稳定性：温度、湿度、 长期观察的系统稳定性：温度、湿度、酸度 OCM 齐冬 2008/5 69 弱红外光监视焦面漂移， 弱红外光监视焦面漂移，对标本无杀伤 Z轴漂移补偿系统 轴漂移补偿系统ZDC原理及特 轴漂移补偿系统 原理及特 点 非软件聚焦，监视容器底部漂移情况， 非软件聚焦，监视容器底部漂移情况，不受标本状态影响 拍照前聚焦， 拍照前聚焦，确保获取长期在焦图像 可以保证最高±0.1 m(40X以上 的聚焦精度 可以保证最高

16、77; 以上 以上 785nm红外激光通过上部光口引入，测量 物镜和反射平面间的距离，反射界面通常 是有反射系数差异的部位，如盖玻片和细 胞表面等。 OCM 齐冬 2008/5 70 35 OCM 齐冬 2008/5 OCM 齐冬 2008/5 71 OCM 齐冬 2008/5 72 36 OCM 齐冬 2008/5 药物高通量筛选相关 UPLSAPO40X OB UPLSAPO40X OB Zoom 2X 17小时，5分钟间隔， Hoechst 33258染色 OCM 齐冬 2008/5 73 荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜原理 基本原理 Zoom成像 成像 扫描速度 3D成像 成像 多通道

17、和光谱 时间相关成像 光操作 AOTF SIM 74 37 OCM 齐冬 2008/5 OCM 齐冬 2008/5 75 强度控制 ND调节 调节 AOTF OCM 齐冬 2008/5 76 38 OCM 齐冬 2008/5 可以扫描任意形状AOTF功能 -保护标本、局部激发、连续调节光强 保护标本、局部激发、 AOTF AOTF QiOCM 齐冬 2008/5 dong 2006,11 77 AOTF声光调制滤光片 激光强度调整， 连续调节0.1%激光强度调整， 激光强度调整 （普通ND滤色片只能 调节） 普通 滤色片只能1调节） 滤色片只能 快速调节-局部刺激和扫描 普通ND滤色片速度 局

18、部刺激和扫描， 快速调节 局部刺激和扫描，普通 滤色片速度 慢 减少荧光粹灭， 减少荧光粹灭，局部扫描 OCM 齐冬 2008/5 78 39 OCM 齐冬 2008/5 Fluorescence Recovery After Photo-Bleaching (FRAP 79 AOTF功能 荧光漂白后恢复（FRAP 荧光漂白后恢复（ OCM 齐冬 2008/5 80 40 OCM 齐冬 2008/5 光操作实验流程 光操作实验流程 实验 单扫描 单扫描单元FRAP Bleaching! time 该过程不记录图像 盲操作） 该过程不记录图像（盲操作） 程不记录图 Relative Intens

19、ity 81 Time 荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜原理 基本原理 Zoom成像 成像 扫描速度 3D成像 成像 多通道和光谱 时间相关成像 光操作 AOTF SIM 82 41 OCM 齐冬 2008/5 双扫描光诱导快速、同步光诱导 快速、 双扫描光诱导 快速 如何完成双扫 如何完成双扫描? 引入了一个独立的扫 引入了一个独立的扫描单元 “SIMS” 同步激光 扫描 OCM 齐冬 2008/5 83 双扫描光诱导系统 在获取图像同时， 在获取图像同时，另外一束激光同时照射 真正的同时性 真正的同时性， 真正的同时性，无任何时间延迟 488nm&543nm获取图像 获 405nm同

20、时激发 同 采图激光 同步激光 OCM 齐冬 2008/5 84 42 OCM 齐冬 2008/5 细胞质内多点快速FRAP 细胞质内多点快速 OCM 齐冬 2008/5 细胞样品来自北京中医医院 85 FRAP & FLIP Relative Intensity Relative Intensity Time FLIP Time FRAP 86 43 OCM 齐冬 2008/5 FLIP (Fluorescence Losing In Photobleach OCM 齐冬 2008/5 细胞样品来自中科院植物所 87 杀死细胞 OCM 齐冬 2008/5 88 44 OCM 齐冬 2008/5 光诱导成像 用特定波长激发诱导 改变荧光染料颜色 改变荧光染料颜色 光转化（Photoconversion） 光转化（ ） Kaede 光聚合、 光聚合、光融解 改变荧光染料灰度 改变荧光染料灰度 光漂白（Photobleaching） 光漂白（ ） 光活化（Photoactivation） 光活化（ ） 光变色（Phot