培养的成熟心肌细胞的形态学与电生理特性

1、    培养的成熟心肌细胞的形态学与电生理特性        摘要：随着分子生物学技术不断应用于心脏的生物物理和分子研究中，培养的成熟心肌细胞越发引人关注。本文综述在培养基中所保持的成熟心肌细胞的收缩性、电生理学和形态学特性。同时介绍近年来开发的有助于在培养基中保持心肌细胞特性的新颖技术。关键词：细胞，培养的；心肌中分类号：Q25文献标识码：A文章编号：1005-3271(2000)02-0116-031细胞形状和超微结构的形态学细胞形状和形态学与某些功能密切联系(例如兴奋收

2、缩耦联1监测这些特性可以指示所发生的电生理学变化。急性分离心肌细胞的特征是“柱状”外形伴有矩形梯形边缘和明显横纹。1 d后培养基中的细胞仍为柱形，有明显横纹；然而细胞边缘在外观上轻微地变圆。培养6天后，细胞仍保持柱状外形和横纹， 而主要变化是细胞边缘渐渐变得更圆，细胞边界的变圆可能是缘于超微细胞的重建。 在鼠心肌细胞， 培养24 h内闰盘内化2，其它形态学变化可能是由于细胞骨架的改建，以适应2D表面。纤细的膜伪足形成并伸出至局部环境中，随着时间的推移，伪足向外伸展，而且开始出现在细胞的其它位置。向层粘连蛋白处理过的表面的吸附过程，以及其后的扩散，在所有无血清介质的标本培养中都是相似的3，4。总

3、而言之，铺开的心肌细胞在培养7 d后有一半以上的细胞保持柱状外形。然而，这高度依赖于分离质量并随之发生相应变化。动物种属和培养条件的区别(例如吸附底物浓度5 和加入培养基中的补充成分3)也很重要。有人使用膜电位敏感性荧光指示器对培养过程中T管密度的变化进行观察1，4。在急性分离的心肌细胞中，可见荧光素标记的横纹结构，覆盖横断面的大部分区域4。其中横纹结构是由于对T管的标记，该结构在缺乏T管系统的心房细胞中观察不到。在培养的心肌细胞中，T 管密度随着培养时间而下降。通过对一群心肌细胞的研究，结果表明T管首先从细胞边缘消失， 而此处也是细胞变圆并发生其它方面结构改变的地方。除了细胞大小(2D 表面

4、面积和细胞密度4)的逐渐减小，T管数量的减小可能是由于膜表面积和净丢失，并且与膜电容的平均值(与膜表面积直接成比例)相一致，都随培养时间而下降4，6。2电生理特性2.1静息电位和动作电位从20世纪80年代早期已开始对急性分离心肌细胞的电生理特性进行了研究。与完整的心肌组织不同，人们有可能完全控制单个心肌细胞的膜电位( 用微电极或patch pipette电压钳技术)， 此外还可用荧光显示器测量细胞内离子浓度的变化7。Ellingsen 等(1993)8的研究提示，通过施加外源性刺激测量心肌细胞的收缩特性来评价培养的心肌细胞特性，可能不是一种可靠的方法。由于心室肌细胞的收缩性和兴奋性受到动作电位

5、(AP)波形和静息电位(RP)的影响，因而，对这些特性随培养时间的变化进行研究也是十分重要的。另外，RP和AP的波形是由基础膜电流决定的，因此，随培养时间RP，AP波形的变化可反映特异电流的改变。有人记录了猫的动作电位，发现分离当天的心肌细胞的AP特征是：先快速上升，继之以一个“明显的切迹”，而后是一个电位在+40 mV0 mV之间的平台期，最后快速复极9, 平均RP为-78.0±0.5 mV。培养14 d后，猫心肌(细胞保持在培养基中，其中补以5小牛血清和5NU血清)已广泛扩散， 只有中心一块区域保持细长并含有完整的肌原纤维9，基本电生理变化是，RP相对去极化(-71.9 

6、7;0.7 mV)，切迹降低，动作电位时程(APD)延长(测量的是APD90)。还有一些心肌细胞在除极后早期也显示出AP，但这在分离当天的心肌细胞中未观察到9。兔的RP和AP在不同培养时间的变化更加复杂4。初分离的兔心肌细胞AP与猫心肌细胞AP十分相似。细胞间AP波形变化很小，但第14 d记录的细胞AP之间有很大差别。第1天心肌细胞的RP均值与分离当天的相似，但细胞间平台期有着本质的不同4。到第4天，RP有所升高且峰电位显著降低。如果应用反向电流将RP超极化至-80 mV， 可导致锋电位上升，表明Na通道并非不可逆的失活，而可能部分失活。2.2培养心肌细胞的膜电位尽管种属间AP波形有所变化，但

7、仍呈现出一定的变化规律：培养心肌细胞的RP与分离当天的心肌细胞相比，显得负值减小且不太稳定4，9。分离当天的心肌细胞的RP接近Ek(K+反转电位)。培养中心肌细胞RP的去极化， 可能是由于膜对K+的通透性降低(与其它内向电导相关)。与此相一致的是，内向整流钾电流Ik1)随培养时间逐渐减弱，用全细胞电压钳从兔心肌细胞中记录的结果可以证实这一点4。分离当天的心肌细胞AP平台期的早期有小切迹，在培养的兔和猫心肌细胞的AP中很少见。ICa-L是心肌细胞的一个特殊性质，目前在该方面已经进行了大量的研究。 培养24 h后,心肌细胞的ICa-L密度峰值增加55，培养48 h后仍大于分离当天的细胞，72 h后

8、返回控制水平8。由培养14 d后的猫心肌细胞记录的ICa-L也显著大于分离当天猫心肌细胞的测量值9。然而，在此研究中，未对ICa-L进行选择性测量。因此，内向电流的显著增大， 可能部分是由于It0减弱或培养物中其它重叠电流所引起，而并非真正ICa-L增强。2.3培养基对离子通道的不同影响对培养心肌细胞进行实验所得的结论之一是，不同的离子通道的表达可以通过各自不同的机制独立地进行调节10。培养基中离子通道调节的可能机制包括: 膜上离子通道的立体位置:那些主要位于培养期间迅速变化区域的细胞(如细胞死亡)上的通道可能比位于稳定区域的细胞通道(如中心区的膜表面)丢失的更快，这对一些锚定在细胞支架的通道

9、十分重要。离子通道表达及转换的调节：表达在细胞膜上的功能性通道的数目依赖于生成通道的数目和通道退化速率之间的平衡。这样看来不像是同一因素控制离子通道的表达和失控。在一些增补血清的培养基的培养中，许多来历来明的活泼性物质影响包括转录、翻译和细胞内膜交通机制在内的细胞生物过程，所有这些物质都可能调节离子通道的表达。调节通道活动的细胞机制的变化：通道的动力学特性可以受磷酸化作用途径和相关调控蛋白(例如：GTP结合蛋白)的调节。如果这些调节途径在培养中改变，那么可能对通道活性产生负面影响。3培养过程中不断施加刺激对心肌生长的影响利用快速粘附的方法培养的肌细胞是静息的，缺少独立的有规律的去极化和收缩，这

10、样可能引起被观察细胞的萎缩。去极化、提高胞浆中Ca2+浓度以及收缩是许多包括离子通道和收缩蛋白表达在内的细胞功能调节的重要刺激11。Kato等人(1995)5研究了培养的猫肌细胞形态和电刺激收缩的蛋白质合成的影响因素。没有受刺激的杆状肌细胞蛋白成分在培养第14天之间以16的速率减少，然后在第7天保持不断地增加，然而经常受刺激的细胞蛋白成分在第14天内保持不变，在第47天开始增加。培养期的蛋白合成速度与蛋白成分的改变相似，这一点说明与蛋白质合成(不是退化)的改变是相关的。Berger等人(1994)12研究以0.15.0 Hz的频率刺激的鼠肌细胞，发现6 h后各收缩指标(峰的移动、收缩和舒张速度

11、)开始下降，直到36 h。 然后收缩功能开始提高，72 h后不断刺激培养的肌细胞各收缩参数值比刚分离的肌细胞高。ICa-L密度与静息细胞相比增大，但没有和刚分离的细胞比较，也没有测量反映收缩功能变化的动作电位。然而这些结论足以说明不断的电刺激可以防止肌细胞的各收缩性质的下降。在培养基中加入维拉帕米抑制培养的鼠肌细胞的收缩可以使收缩功能(维拉帕米洗脱后测量)下降到和没有受刺激的肌细胞同一水平12，这就说明是收缩而不是膜去极化使肌细胞保持着电机械功能，培养中受刺激的心肌细胞总蛋白成分和蛋白合成速度明显高于静息培养的细胞，这和从猫肌细胞得到的结果一致5。这些结论说明细胞发生肥大是因为工作负荷的升高而

12、不是任何的额外的生长因素，虽然在血清中也存在外源激素和生长因子，但如果利用加入血清的培养基进行实验则得不到这样的结论。4结语对培养的成熟心肌细胞的各种特性的研究难度很大，受多种因素的影响，培养环境的控制可改善体外成熟心肌细胞的正常生理特性，在培养中不断地给予电刺激，即是一种比较新颖的技术13。要使培养心肌细胞长期保持活性和正常的生理特性，还有更多的工作需要去做，同时，在分析培养细胞的资料时需要小心，因为电生理学特性随时间的变化可能缘于培养环境的细微变化。因此，实验性干扰的结果，应与时间配对对照，这样才更科学。作者单位：商立军（第四军医大学生理教研室， 西安 710032）臧益民（第四军医大学生

13、理教研室， 西安 710032）朱妙章（第四军医大学生理教研室， 西安 710032）周士胜（第四军医大学生理教研室， 西安 710032）臧伟进（西安医科大学心血管生理药理研究室）参考文献1Lipp P, Huser J, Pott L, et al. Spatially non-uniform Ca signals induced by the reduction of transverse tubules in citrate loaded guinea-pig ventricular myocytes in cultureJ. J Physiol, 1996,497(3):589.2J

14、acobson SL,Piper HM. Cell cultures of adult cardiomyocytes as models of the myocardiumJ. J Mol Cell Cardiol ,1986,18:661.3Volz A,Piper HM,Siegmund B,et al. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary cultureJ. J Mol Cell Cardiol, 1991;23:161.4Mitcheson JS,Hancox J,Lev

15、i AJ. Action potentials,ion channel currents andtransverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell cultureJ. Pflueg Arch, 1996,431:814.5Haddod CJ,Decker ML,Hsieh LC,et al. Attachment and maintenance of adult rabbit cardiac myocytes in primary cell cultureJ.

16、Am J Physiol，1988，255:C19.6Mitcheson JS,Hancox J,Levi AJ,Cultured adult abbit myocytes: effect of adding supplements to the medium and response to isoprenalineJ. J Cardiovasc Electrophysiol, 1997,8:1020.7Wier WG. Ca2+i transients during excitation-contraction coupling of mammalian heartA. In: Fozzar

17、d HA, Haber E, Jennings RB, et al. editors. The heart and cardiovascular systemM. New York: Raven Press, 1992:1223.8Ellingsen O,Davidoff AJ,Prasad SK,et al. Adult rat ventricular myocytes cultured in defined medium:phenotype and electromechanical functionJ. Am J Physiol Heart Circ Phsiol， 1993，265:H

18、747.9Schackow TE, Decker RS, Ten Eick RE. Electrophysiology of adult cat cardiac ventricular myocytes: changes during primary cultureJ. Am J Physiol Cell Physiol， 1995，268:C1002.10 Feng JL,Li G,Fermini B,et al. Properties of sodium and potassium currents of cultured human atrial myocytesJ. Am J Physiol, 1996,270:H1676.11Davidoff AJ,Maki TM,Ellingsen O,et al. Expression of calcium channels in adult cardiac myocytes is regulated by calciumJ. J Mol Cell Cardiol, 1997,29:1791.12 Berger HJ,Prasad SK,Davidoff AJ,et al. Continual electric field stimulation preserves contractile fun