人源化单克隆抗体研究进展

1、收稿日期:2008205209;修回日期:2008205213作者简介:吴永强(19762男,博士研究生,助理研究员,主要从事噬菌体单克隆抗体的研究工作。人源化单克隆抗体研究进展吴永强1综述;董关木2审校(1中国生物技术集团公司武汉生物制品研究所,武汉 430060;2中国药品生物制品检定所,北京 100050摘 要:尽管通过几种展示文库和转基因小鼠已经可以制备人源单克隆抗体,但是人源化鼠源单克隆抗体使之用于人体治疗仍为抗体研究领域的热点。本文总结了单克隆抗体人源化的几种方法,并对其将来的发展进行了展望。关键词:单克隆抗体;人源化;研究进展中图分类号:文献标识码:A文章编号:100525673

2、(2008022*通过免疫的、天然的以及合成的抗体库展示技术112或者是利用转基因小鼠122虽然可以获得人源单克隆抗体,但是经进一步改造传统的杂交瘤技术所制备的大量鼠源单克隆抗体,仍然是目前开发用于人类疾病治疗的一种可能途径和源头。如若将这些特异性和亲和力较强的非人源单抗进行人源化改造后,仍然比从头开始以新的靶点来开发治疗性单抗制剂更有应用前景。早期的临床试验证明鼠源性单抗为异种蛋白应用于人体后132,可引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应,产生人抗鼠抗体(H uman anti 2mouse an ti b ody ,HA MA 应答,重复使用时甚至可导致病人严重的过敏性休克;其次鼠单

3、抗通常不能有效激活机体的生物效应功能,如补体依赖的细胞毒及抗体依赖的细胞毒作用。此外,由于HA MA 反应的存在,鼠单抗在人体内往往被快速清除,其半衰期也较短。随着对各类抗体结构和氨基酸序列、及其变异的种属和功能之间关系的深入了解,而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。抗体的应用经历了非人源抗体、人2鼠嵌合抗体、人源化抗体、Pri m a 2tiz ati o n14282,最终可到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。其中将动物来源的单克隆抗体人源化(Monoclonal human ization,以降低这些单抗的免疫原性使之可成为用于人类疾病的治疗,仍然是目前研究的

4、一个热点。本文就人源化单克隆抗体的研究进展作一综述。至今人源化单抗通常使用的方法主要有嵌合(Ch i m erization192、重构(Reshap i n g和表面重塑(Resurf aci n g1102。1嵌合抗体用人源抗体恒定区取代鼠单抗恒定区而构建的人2鼠嵌合抗体14,72,已被证实保留了其亲本鼠单抗的特异性抗原结合能力并能够降低免疫原性,目前美国正式批准上市的4个人2鼠嵌合抗体产品在临床应用中取得良好效果。嵌合抗体就是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区,仍保留了原来鼠源抗体约30%左右的鼠源序列,其免疫原性虽有所降低,但仍可引起不同程度的HA M A 192142应答。为了降低

5、在嵌合抗体中鼠源部分,只移植鼠抗体互补决定区(Co mple mentarity deter m ining re i g n,CDRs,而不移植整个抗体可变区,所构建的/嵌合0抗体随后就成为了研究热点1152。Roberto 等1162认为抗体CD R 区中仅有部分与抗原相接触的氨基酸残基,决定该抗体的特异性,这被称之为特异性决定残基(Spec ific ity 2D eter m ining Resi d ues ,S DRs,Roberto 等在构建嵌合抗体时,仅仅移植CD R s 区内这些必需的SD R s 到人抗体框架区,成功地改造了一个抗癌胚抗原的鼠源单抗C OL 21,显著地降低

6、了其免疫原性,临床显示了很好的治疗效果。无论CDRs 或SD R s 移植所构建的/嵌合0抗体与其亲本非人源单抗相比,其抗原的亲和力都有一定程度的降低,因为亲本非人源单抗框架区的某些氨基酸位点参与了抗原结合或者对维持抗原结合区构象具有重要作用1172。同时在对大量的嵌合抗体研究中发现有时其生物学效应并不一定完全与预期设想相符1182。2抗体改型技术(An ti b ody r eshap ing的应用每一抗体分子Fab段的轻、重链可变区具有6个抗原互补决定区(CD R。CDR1、CD R2和CDR3之间有一个起结构稳定作用的框架区(FR,即以FR分隔而起支架作用,共同形成CD R平面可直接接触

7、抗原,决定抗体的特异性,FR只是作为支持CDR的支架,而且其立体构象极为保守。改型抗体就是移植非人源抗体的CDR到人抗体骨架区(Fra me work region,FR,同时维持与亲本非人源抗体相似的CDR构象构建而成的人源化抗体1192222。相对于亲本非人源抗体和嵌合抗体,改型抗体仅有9%来源于亲本非人源的单抗,经临床试验证明,其改型抗体的免疫原性得到显著降低1232。在抗体改型试验中1192222,为了使改型抗体与其亲本鼠单抗和抗原相结合的特异性及亲和力尽可能一致,就必需保证改型抗体与其亲本抗体有相似的抗原互补决定区立体构象。众多实验证明,在FR 区某些关键位点上保持原有的氨基酸残基对

8、抗原互补决定区构象至关重要,通常这些位点应被同时移植到人抗体FR124,172。如果仅仅移植CDRs至人抗体FR而忽视这些关键位点上的氨基酸残基,其抗原互补决定区的构象会将发生较大的改变125,262。然而,CDR构象的微小改变均可能导致抗原亲和力降低117,262。多数情况下,仅仅移植CDRs到人抗体FR上产生的改型抗体将丧失全部或大部分抗原亲和力,只有同时再移植某些关键位点的氨基酸残基(通常该位点的氨基酸残基维持着高变区的构象后才能保持改型抗体的抗原亲和力。所以,如何识别这些影响CDRs构象的框架区氨基酸残基位点就显得尤为重要,尽管Foote and W i n ter定义了单抗框架区关键

9、氨基酸位点的/游标0区(Vernier z one1172,亲本鼠单抗的这些位点氨基酸残基应当保留在人源化抗体中,但是一般来说还是要通过更多的经验分析或计算机模拟分析,并进一步的实验验证才能更准确的定位这些关键氨基酸位点,并将其保留在改型抗体中1272312,以维持改型抗体与抗原的亲和力。3抗体表面重塑技术(An tibody r esurfa cing的应用1991年Padlan提出了利用表面重塑的方法来改造非人源抗体,此方法的原则就是将非人源单抗可变区(Fv表面非人源的基酸残基替换为人源性的氨基酸残基132,332,使非人源抗体Fv区的表面人源化,降低其免疫原性,同时不影响Fv区的整体空间

10、构象,从而保留其抗原结合部位的结构。这个方法的程序是首先模拟抗原结合区构象,然后识别框架区非人源的氨基酸残基,最后将非人源的氨基酸残基人源化。表面重塑抗体应用于人体时是否会引起免疫应答,迄今尚未见有临床报道。2006年Stae lens等用表面重塑的方法改造了抗血管假性血友病因子鼠单抗82D6A3,将抗体可变区10个鼠源氨基酸残基替换为人源残基,获得了很好的结果1342。表面重塑技术优于移植重构技术,在设计人源化抗体时更简单一些,因为该技术仅需改变表面残基即可,而保留了大量内核的非人源残基。所以重塑抗体中抗原结合区构象及相对位置与原有抗体更为接近。另一方面,重构抗体在用于人体感染、自身免疫疾病

11、、Neoplastic疾病治疗时表明,仍有微弱的免疫原性,而重塑抗体目前仍未见有临床实际应用的报道。表面重塑技术的基本理论依据是,暴露于表面的氨基酸残基在免疫原性方面起重要作用。然而与重构抗体相比,重塑抗体中含有大量的非人源残基,因此可能会导致更大的异源免疫排斥反应的发生,尤其考虑到抗原提呈过程1322。4利用计算机模拟技术,对鼠源抗体的人源化改造计算机与生物技术的发展日臻成熟,使其应用于抗体人源化改造成为可能,指导抗体改型和抗体的表面重塑,取得了很好的效果。通过对抗原2抗体相互作用的模拟,对抗体分子微观构象与一级序列之间关系的推测,减少了抗体人源化过程中的盲目性。在非人源抗体的表面重塑试验中

12、,以鼠源单抗为例,通过Kabat数据库比对轻、重链各亚型的基因序列136,172,亲本鼠源抗体可变区表面非保守氨基酸残基应予替换成人的氨基酸残基124,32,332。如上所述,为了保持表面重塑抗体与亲本抗体对抗原结合的特异性及亲和力尽可能一致,因此需在某些关键位点保留其原有的氨基酸残基1282312。识别亲本鼠抗体可变区人鼠间非保守的氨基酸残基,可通过计算机技术对抗体轻、重链基因序列的同源性结合共有序列(Consensus sequences法进行比对132,37,412,该共有序列可以通过标准的数据库搜索程序来完成1382402。在抗体重构试验中,识别人源抗体框架区中影响CD R构象的氨基酸

13、残基位点非常关键。基于对抗原2抗体相互作用的计算机模拟,并分析氨基酸残基、CDR的几何距离和分子间氢键作用力,可以推测出这些关键氨基酸残基的位点,指导抗体重构试验1422。Zhang等1422通过计算机模拟技术,成功地改造了抗hTNF2A的鼠单克隆抗体Z12。首先使用FAS2 TA、BL AS TP和蛋白质3D结构数据库PDB进行同源性比对,确定了以亲本鼠Z12抗体结构和序列相似性最高的人抗体FV区序列作为其人源化的模板,用分子对接技术模拟Z12Fv/hT NF2A复合体的结构,找出抗体FR影响CD R s抗原结合构象的关键氨基酸残基。发现有4个位点的氨基酸残基参与抗原接触,有5个位点的氨基酸

14、残基对维持CD R s构象起关键作用,所以在人源化抗体中保留了这9个位点的氨基酸残基,另有6个氨基酸残基位点,通过建立噬菌体抗体库的随机筛选,完成了对抗体Z12可变区进行表面重塑的人源化改造。5通过抗体库技术对非人源抗体进行人源化5.1用噬菌体展示抗体组合文库技术优化人源改型抗体在通过CDR移植构建人源改型抗体时,最为困难的关键步骤是确定可影响抗原结合活性的骨架区残基,利用分子模建进行立体构象分析仅能大致提示选择分子残基,得到理想的改型抗体具有较大难度,往往需要经过反复构建、表达及测试才能获得。由于抗体库技术具有强大的可供筛选的能力,以确定其须要移植的骨架区残基。先通过分子结构分析找出可能影响

15、抗原结合部位立体结构的骨架区残基,将这些残基的非人源副本和人源副本同时组合到一个抗体库中,或将这些残基随机化,通过筛选过程寻找最佳组合,确定哪些位点须要保留亲本鼠源残基。如Rosok等1432对Le w i s Y鼠源单抗进行人源化时,通过分子模建选择了7个骨架区残基,在合成人源改型抗体可变区基因时将这些位点分别设计成人源残基和鼠源残基两种,这样7个残基共有128个组合,构建了一个噬菌体抗体库,通过筛选获得了亲和力与亲本鼠单抗接近的组合,确定了需要保留的亲本鼠单抗骨架区残基。Baca等1442在对VEGF 鼠单抗进行人源化时则选择了13个残基进行随机化,获得了理想的结果。Tsur ush it

16、a等1452在对鸡I L2 12单抗进行人源化时,通过结合计算机的模型模拟,选择了11个框架区氨基酸残基位点进行随机筛选,获得了与亲本单抗亲和力及特异性相似的人源化抗体。5.2噬菌体展示组合文库对抗原表位定向选择Jespers等1462以鼠单抗可变区为模板,利用噬菌体展示技术,通过抗原导向,筛选能够模拟鼠单抗可变区,结合相同抗原决定簇的人源抗体,称为抗原表位定向选择,或表位印模选择(E pitope i m printed se lecti o n,E I S。其基本过程如下:选择亲本鼠单抗的轻链可变区基因与人源抗体的重链可变区基因文库配对构成/鼠2人杂合抗体库0,用相应的抗原筛选有结合活性的

17、克隆,得到可与该鼠单抗可变区配对,组成具有特异结合活性的人源重链可变区基因,再将此重链可变区基因与人源轻链可变区基因文库组合构建成人源抗体库,再次进行筛选,得到特异性与亲本鼠单抗完全相同的人源单抗。但这个方法有时所获的人源化抗体与抗原的结合特异性会产生漂移,与亲本鼠单抗有所不同。可变区CD R3是决定抗体特异性的关键部位,而由于CD R3巨大的多样性,本身并不具有明显的种属特异性,因此将亲本鼠单抗的CDR3预先重组到人源抗体可变区文库中,取代人源抗体的CDR3,能够克服抗原2抗体结合特异性漂移的问题。Bei2 boer等1472对抗EGP22肿瘤相关抗原的鼠抗体MOC2 31进行人源化时,先用

18、鼠Fd段与人J、K轻链组合文库配对,构建两个杂合抗体库,从对应的人轻链J 库中筛选到杂合Fab,进而确定了人源化的轻链序列。再用所获得的人轻链与移植有MOC231V H CDR3的人Fd文库组合成人源抗体库,筛选到多株人源化单抗,它们保留了亲本鼠单抗的特异性,且亲和力高于或等于亲本鼠单抗。Rader等1482在对抗整合素A v B3鼠单抗人源化时,对人轻链和重链文库分别预先组合了亲本鼠A v B3单抗的V L CDR3与V H CDR3,然后采用同样的方法进行筛选,获得了比较满意的结果。Da ll.A cqua等1492采取/Fra me work shu f fling0的方法进一步简化了抗

19、原表位定向选择法,用来改造抗酪氨酸激酶受体EphA2的Mc Ab B233取得了成功,其基本原理是:由于抗体Fab段是由3个CDRs 与框架区序列间隔排列所组成的,Dall.A cqua等通过整理公开的数据信息,建立了一个人源框架区序列库,将51个人J链框架区序列与Mc Ab B233的3个轻链CD R s连接,并与Mc Ab B233的重链组合构建一个噬菌体展示Fab文库,用EphA2进行筛选,确定了/Fra me wor k shuffli n g0后的轻链序列;然后再将50个人重链框架区序列与M c Ab B233的3个重链CD R s相连接,并与筛选到的轻链相组合构建了另一个文库,用同

20、样的目的抗原筛选得到/Fra m e2 wor k shuffling0后的重链序列。这个方法的优点是不需要事先对抗体结构进行设计,可适用于任何其他抗体的人源化改造。改型抗体与表面重塑抗体相比较,是从不同角度解决人源化的问题,表面重塑抗体不必从一级序列上进行人源化,而是仅仅从抗体2抗原识别的角度出发,改变那些抗体识别的表面氨基酸残基。从技术操作上,两种线路展示了相同研制手段的两个侧面,都是先通过分子设计构建可变区立体构象;CDR 移植是在人可变区基础上确定哪些氨基酸残基必须保留具有抗原特异性的亲本鼠源性,而表面重塑人源化则是在非人源可变区基础上确定哪些残基需要改为人源性。噬菌体展示技术能将特定

21、分子的基因型和表型统一在同一个病毒颗粒内,可同时提高其选择能力和扩增能力,作为抗体技术领域中令人瞩目的新进展,目前已显示其取代杂交瘤技术的趋势,特别在抗体人源化的应用中已逐渐成为常规的实验手段。参考文献:112M c Caffert y J,G riffit h s A D,W i nter G,et a.l Phage anti bod ies:fil2 am entous ph age d is p layi ng anti body vari able do m ai n s1J2.Nature1990,348:5522554.122G reen L L.An ti body engi

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