柱层析相关知识

1、柱层析技术百科名片柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相， 将蛋白 质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上 洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数 不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。目录展开 简介根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析 和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。柱层析分离净化的实验技巧和方法 柱层析操作方法的选择目前，柱色谱分离的操作方式 ，主要包括常压分离、 减压分离和加压 分离3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单，但是洗脱时间长。减压分离尽管

2、能节省填料的使用量，但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，并且有时在柱子外面会有水汽凝结，以及有些易分解的化合物也难以得到，而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间，是一种比较好的方法，与常压柱 类似，只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵等。柱子规格的选择市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了，相应的塔板数就高，分离就好。目前市场上的柱子，其径高比一般在1: 510范围，在实际使用时，填料量一般是样品量的3040倍，具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大，就可以减少填

3、料量,使用内径相对较小的柱子（女口 2cmx 20cm的柱子）；如果Rf相差不内径的柱子。到，就要加大柱子，增加填料量，比如用3cm 装柱,湿法省事，一般用淋洗 ，但溶剂越少越好，不然溶,否则会被淋洗剂带 干法和湿法装柱没什么实质 装完的柱子应该有适度的紧密柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种 剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂 到淋洗液中，可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。 性差别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密（太密了淋洗 剂流速太慢），并且一定要均匀，不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中 不能有大气泡，大多数情况下有些

4、小气泡没太大的影响，因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂，开裂会影响分离效果 ，甚至报废。溶剂的选择在选用柱层析洗脱剂时、亲合性（Affinity）安全、 环保的，可以考虑选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。首先要考虑三个方面的因素：溶解性（Solubil2ity）和分离度（Res oluti on）。溶剂应选择价廉、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高，乙醚很易挥发，二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程，易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少，要依不同需要选择。另外值得一提的是，由于我们进行的是痕量分析，淋洗剂的纯度必须关注，一般使用农

5、药残留级或HPLC级的，如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后 最好回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费。上样，待溶剂层下,如此两三次，,等溶解样品用少量的溶剂溶解样品加样，加完后将底端的活塞打开降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞 一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压的溶剂和样品层有一段距离（24 cm）,再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大，上样后在柱上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差 ,能溶解的溶剂（比如DMFQMSO等）又不能上 柱，

6、这样就必须用干法上柱了。淋洗液的收集和浓缩用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出，这时可以采用氧化铝作固定相。 柱层 析后的淋洗液，由于使用了较多的溶剂 ，必须进行浓缩，如果待测物具有 一定的挥发性，最好使用常压挥发溶剂 ，否则易导致检测结果偏低。硅胶层析目录展开性状：该产品为白色均匀颗粒，主要成分为二氧化硅，由优质硅胶为原 料加工制成。其主要特点是能通过对混合物质中的不同成分吸附保留时间的 差异，达到分离提纯的目的。依其纯度又分为工业级粗孔柱层析硅胶、试剂级柱层析硅胶。用途：主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分 的分

7、离提纯，高纯度物质的制备等。规格：国际惯例：63-212卩 m( 70-230 目)；38-63卩 m( 230-400 目)国内常规：150-250卩 m ( 60-100 目); 75-150卩 m ( 100-200 目); 45-75卩m ( 200-300目)(也可按用户需求加工成其他规格) 硅胶表面结构概述在色谱和工业水处理领域中，无定形硅胶已得到了广泛的应用，它具有多孔的无定形结构，不产生任何x射线衍射1,4。硅胶的表面存在着硅醇基团(si-oh)和暴露的硅氧烷键(si-0-si)。硅醇基团是强吸附的极性基团， 而硅氧烷键是疏水基团。硅氧烷键上的S键被dn -pn作用而加强，氧原

8、子上的孤对电子参与n作用，不能参与给体与受体间的相互作用，不能形成氢键。scott和kucera证实硅氧烷基团几乎不吸附极性溶剂分子。然而， 由于硅氧烷键的疏水作用性，可以吸附某些非极性溶剂分子。对硅胶改性而 言，硅醇基比硅氧烷基重要得多。硅醇基团可以孤立、 成对(双生)和缔合(连一般情况下，随着比表面积的增加, 通常硅醇含量的测定方法有同位素交 nawrock1报道了用同位素交换法测 而且这个数值常常被视为硅胶的物 pka值是。通过对硅胶表面位)等不同的方式存在于硅胶表面。最近研究表明，不仅两个或两个以上的 缔合硅醇基团可以形成键合对，甚至成对硅醇基团也可以形成键合对。硅胶 表面的结构可以通

9、过许多方法进行测定。 硅胶表面上硅醇基团的浓度略有降低。 换法、滴定法、光谱法和烷基铝法等。 定硅胶表面的硅醇基浓度是±卩mol/m2， 理化学常数。硅醇基团具有明显的酸性，测定的 的结构分析，可知硅胶表面硅醇基的类型、浓度和表面分布都会影响所制备 键合相的性能，而硅胶的预处理则可以改变表面硅醇类型的分布，提高表面 的缔合硅醇的含量，改善硅胶表面键合相的性能。硅胶柱层析技术硅胶柱层析原理硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下 极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸 附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。硅胶柱层析流动相极

10、性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极 性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅胶柱层析惯用方法1. 称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶 耳干硅胶的视密度在左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。2. 搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸 乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置 干燥。氯仿用无水氯化

11、钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。3. 装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降， 会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4. 压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5. 上样。干法湿法都可以。 海沙是没必要的。 上样后，加入一些洗脱剂， 再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而 不会

12、冲坏硅胶表面。6. 过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H,收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300 目）, 20-50ml收一馏分。7. 检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。8. 送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或 为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱左右所 谓的“硅胶”峰。注意事项2. 将柱子必须装平整、均匀3. 考虑有限柱填料的吸附量4. 可考虑用剃度法分开并洗脱柱层析分离

13、的实验方法和技巧1B= vrGq常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或 氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来 过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。:柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱 子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也 最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于 大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有 些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵

14、抽气（很大的噪 音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但 是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂 走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的 就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂 走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。二：关于柱子的尺寸应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后 样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分 离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品

15、就有二厘米，那么分离的难度可想 而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有厘米，那么各 组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的 说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。En 8-Hc#NC30现在见到的柱子径高比一般在1 : 510,书中写硅胶量是样品量的40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在 所需组分rf在，杂质相差以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如 毫克的样品，用2cmK 20cm的柱子）；如果相差不到，就要加大柱子，我觉 得可以增加柱子的直径，比如

16、用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。三：关于无水无氧柱适用于对氧，水敏感，易分解的产品，可以湿柱，也可以干柱。不过在 样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量200有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分 离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱

17、，需要六个 schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。 而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵 些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出 来大家参详参详。四：关于湿法、干法上样湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等， 但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。 很多样品在上柱前是粘乎乎的， 一般没关系。可是有的上样后在硅

18、胶上又会析出，这一般都是比较大量的样 品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体 才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结 晶，那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMFQMS等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样 品和硅胶的量有一种说法是 1:1,我觉得是越少越好，但是要保证在旋干 后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。五：溶剂的选择当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚， 乙酸乙酯。 文献中有写用正己烷的

19、，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流 的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用， 但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。 二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏 天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇据说能溶 解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。Q7&Y y25由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用 10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低

20、的。经常能 够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比 较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正 下面还有提纯的方法。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省 部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进 行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的 变化，一般会使得极性变大， 在梯度淋洗时比较合适， 正好极性越来越大了。 在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸 点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样 品有反应那就惨了。六：

21、关于操作问题1、装柱柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采 用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。 装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不 然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多 数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装 的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖 的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！2、加样用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至 石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一

22、般 石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂 和样品层有一段距离（24cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二 氯甲烷等）夹带样品快速下行。3、淋洗剂的选择感觉上要使所需点在左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在，即使相差也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：一次的分离度，肯 定不如（）的三次方或四次方大。4、样品的收集用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出， 而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外

23、，收集的试管大小要 以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样 品，WUWL。如果都用小试管那工作量又太大。5、最后的处理柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂， 其中的杂质也会累积到产品中， 所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在 溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果 是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现 这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高， 挥发相对小的溶剂。 还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和

24、石油醚（6090）,而乙醚却要选择 30- 60的石油醚。二是：不论是用带 砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法将空气排干， 这样就可避免柱中有空气！2010年12月22日星期三硅胶柱层析原理硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附， 极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个 层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。编辑本段硅胶柱层析流动相极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的 用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 编辑本段硅胶柱层析惯用方法1.称量。200-300目硅

25、胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用 100 倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在左右，所以要称 40g硅胶，用烧杯量100ml 也可以。2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系， 就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。 氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。 3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆

26、一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶 沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以 避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可 以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收 集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，收一馏分；1-2g上样量，5

27、0g硅胶（200-300 目）, 20-50ml收一馏分。7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过 一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱左右所谓的硅胶”峰。注意事项1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质 Rf值之差最大化2.将柱子必须装平整、均匀3.考虑有限柱填料的吸附量4.可考虑用剃度法分开并洗脱柱层析浅谈极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅胶

28、柱层析下面介绍惯用的方法： 匀浆法。1。 称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。 干硅胶的视密度在左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。2。 搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆， 说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。3。 装柱。将 柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加

29、入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球， 打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约 被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且 可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉 塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的

30、例子：10mg上样量，1g硅胶H，收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300 目），20-50ml收一馏分。7。检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一 般比喷显剂底1-2个数量级。&送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小 凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱左右所谓的硅胶”峰。1. 先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化2. 将柱子必须装平整、均匀3. 考虑有限柱填料的吸附量4. 可考虑用剃度法分开并洗脱关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。 柱子粗

31、了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品那么不层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那 么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有厘米，各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就1: 510,书中写硅胶量是样品量的3040倍，具体的选择rf在，杂质相差以上）： 2cmX20cm的柱子）；如果相差不到， 3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在要具体分析。如果所需组分和杂

32、质分的比较开（是指在所需组分 就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用真空液相层析即 vacuum liquid chromatogra phy(VLC),就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用 等。即用真空代替压力进行层析，具体方法可见 Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222-干法上样，一般用于固体或粘度大的液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解，加入1-3倍的粗硅胶，晾干或旋干，干燥的标准是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好的柱子上留一段溶剂，把吸附了样品的硅胶慢慢到进去，震动柱子或再加一些溶剂，把粘在柱壁上的

33、硅胶洗下常说的过柱子应该叫柱层析分离， 也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。 由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 柱子可以分为：加压，常压，减压。所以其 一个 但是由压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且

34、时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压 的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样 品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分 解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离

35、的东西比较敏感，所以接收瓶 一定要用可密封的，遵循 schlenk操作。至于是 加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。 如果样品无色，只好准备几十个schle nk 瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水很容易是样品分解，特别是金选择余地比较大，但无氧柱，需要六个 schle nk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多 的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的， 是比

36、硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。关于湿法、干法上样。湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等， 但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出， 这一般都是比较大量的样品才会出现， 是因为硅胶对样 品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生， 这就应该先重结晶，得到大部分的 产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶

37、解 的溶剂又不能上柱（比如 DMFQMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1 :1,我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品 没有吸附在硅胶上）。注意保持清醒别溶剂的选择。当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献 中有写用正己烷的， 太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不 过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是 一个放热过程，所以夏天的时

38、候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇, 据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理， 比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。 经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般

39、在过柱同时进行的是减压 旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压， 因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。关于操作问题。1装柱。柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。 干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密 了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到 气泡，我觉得在大多数情况下有些

40、小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。 当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂， 甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！2加样。用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时， 再加少 量的低极性溶剂，然后再打开活塞， 如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。 加入淋洗 剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（24cm就够了），再加压，这样3淋洗剂的选择。感觉上要使所需点在左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果 rf在，即使相差也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次 爬板的状态，可以通过公式的比较：一次的分离度，肯定不如（）的三次方或四次方大。4样品的收集。用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出