不同化疗敏感性下咽鳞癌差异基因表达谱的筛选

1、不同化疗敏感性下咽鳞癌差异基因表达谱的筛选【摘要】目的 筛选化疗敏感性不同的下咽鳞癌差异基因表达谱，探讨基因表达谱预测下咽鳞癌化疗敏感性的可能性。方法 选取诱导化疗敏感和不敏感的下咽鳞癌各4例，分别提取mRNA，体外反转录为cDNA和cRNA，不同生物素标记和片断化后制成cRNA探针，与人类基因组芯片杂交，对杂交信号扫描并归一化处理，使用GCOS 4.0统计软件分析。以Signal Log Ratio1和change Pvalue0.05为标准筛选差异表达基因并根据生物学过程和功能分类。 结果 筛选差异表达基因119条，其中上调基因65条，下调基因54条。差异表达基因包括信号传导(STAT3)

2、，细胞周期(CCND1、TCF7L1)，细胞凋亡(FADD)，黏附分子(MUC4、cadherin 11、ICAM2)以及酶类等，化疗敏感组中EGFR、TGF和TNFR等细胞信号通路异常。结论 不同化疗敏感性的下咽鳞癌基因表达谱不同，根据基因表达谱的变化评估化疗敏感性是可能的。 【关键词】 下咽；鳞癌；化疗；敏感性；基因谱 Screening Gene Expression Profiling from Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma of Different Sensitive to Chemotherapy XING Haijie*,ZENG

3、Zongyuan,GUO Zhuming,YANG Ankui,LI Hao State Key Laboratory of Oncology in Southern China;Sun Yatsen University,Guangzhou 510060，China(*Present:Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery,Wuhan University Science and ) Key words：Hypopharyngeal; Squamous cell carcinoma; Chemotherapy; Se

4、nsitivity; Gene expression profiling前瞻性研究表明有效的诱导化疗可提高下咽鳞癌患者器官保存率13。随着肿瘤功能保全治疗观念的普及，功能保留成为评价临床疗效的重要指标。在头颈肿瘤中,化放疗是重要的功能保存治疗方案，但至今缺乏准确实用的化疗敏感性预测方法。 近年来，使用基因表达谱技术预测肿瘤表型包括病理分化、淋巴结转移状态、生存、复发以及治疗反应等49，显示出良好的应用前景,但用于评估下咽鳞癌化疗敏感性的临床应用研究未见报道。本研究目的是探讨化疗敏感性不同的下咽鳞癌基因表达谱的变化，筛选差异基因表达谱，探讨应用基因表达谱预测下咽鳞癌化疗敏感性的可能性。 1 材料

5、与方法 1.1 材料 1.2 方法 1.3 统计学方法 杂交芯片扫描数据使用GCOS 4.0统计软件处理。在比较两张芯片数据前，对芯片数据进行归一化(Normalization or Scaling)处理。(Normalization方法：将芯片所有探针组的Signal从小到大排序，去掉最大的2%和最小的2%，将剩下探针组的平均信号值调整到500)，以Signal Log Ratio1(在两张芯片相比较时代表了一个转录本变化的大小和方向，和change Pvalue0.05(代表两张不同的芯片之间一个探针表达水平相同或不同的可能性)作为筛选差异表达基因的标准。组间比较采用SPSS10.0统计软

6、件包中的列联表卡方检验进行，取P0.05为有统计学意义。 2 结果 2.1 芯片质量检测 敏感和不敏感组cRNA探针与Test chip芯片杂交扫描结果见图1、2，图上方的Gene Chip TEST字样和四角的点及中央的“+”均清晰可见,芯片扫描图内点线分布较均匀，表明cRNA探针质量较好。 化疗敏感组和不敏感组cRNA探针与人类Focus2.0型基因芯片杂交结果，见图3、4。检测表明两张芯片中的看家基因actin 等的5端和3端均被检测到，比值明显低于3.0的标准，外加的阳性对照BioB、BioC、BioD等也被检测到，信号强度随着浓度由低到高呈现出由弱到强的变化，表明芯片检测质量较好，结

7、果可靠。 2.2 芯片检测结果 化疗敏感组与化疗不敏感组相比，119条基因表达异常，表达上调基因65条，表达下调基因54条，Signal Log Ratio比值为1.07.5， 根据GO（Gene Oncology）分类，将差异表达基因按生物学过程和分子功能进行分类（表2为部分数据）。异常表达基因包括细胞信号传导(STAT3)，细胞周期控制(CCND1、TCF7L1)，细胞凋亡(FADD),细胞黏附(MUC4、cadherin 11、ICAM2)和酶类(MMP2、AKAP7、CDKN2A)等。 2.3 差异表达基因免疫组化检测表2 敏感组中表达上调(Signal Log Ratio1)基因和下

8、调(Signal Log Ratio1)基因 随机选取CD1和STAT3作为验证基因，在12例(包括用于筛选差异基因8例)标本中，CD1和STAT3免疫组化检测阳性表达率为敏感组100%（6/6）和83.3% (5/6)，见图5、7，不敏感组为16.7%（1/6）和无表达(0/6)，见图4、图6。两组相比，CD1和STAT3阳性表达率均有统计学差异(25.486，P0.019；25.486，P0.019)，显示基因芯片杂交结果可靠。 3 讨论 基因表达异常与肿瘤发生进展密切相关,并决定肿瘤生物学特性，即肿瘤表型。 与正常细胞相比，口腔鳞癌细胞有不同基因表达谱：MMP1、MMP10和MMP12,

9、层粘连蛋白等基因表达上调,细胞凋亡相关基因表达下调,因而,口腔鳞癌具有侵袭性生长，早期出现淋巴结转移等特点11。早期下咽鳞癌中有119条基因表达异常。其中，细胞基质相关基因表达异常与下咽鳞癌侵袭性生长密切相关。同时,复发与控制的下咽鳞癌也有不同的基因表达谱，显示同一肿瘤预后不同,基因表达谱不同12。不同淋巴结转移状态13,14、生物学特性和病理类型的肿瘤中 也存在不同基因表达谱1518。 本研究化疗敏感组中，119条基因表达异常,包括信号转导(STAT3)，细胞凋亡(FADD)，细胞周期(CCND1、TCF7L1)，细胞黏附(MUC4、cadherin 11、ICAM2)以及酶类(AKAP7、

10、CDKN2A、MMP2)等,其中65条表达上调，54条表达下调,这些基因表达水平的变化与化疗敏感性存在关联,显示化疗敏感性不同的下咽鳞癌具有不同的基因表达谱。 在信号传导类基因中，信号转导和转录激活因子3(STAT3)是STATs/JAK信号途径关键因子之一。应用G四联体寡核苷酸干扰STAT3的SH2结合区可以抑制头颈肿瘤细胞的生长，是头颈肿瘤潜在的治疗靶点19。Hsiao等20报道鼻咽鳞癌中STAT3阳性率为70.5%,且与预后相关。在本研究化疗敏感组中，STAT3基因表达阳性率为83.3% (5/6),高于不敏感组(P0.05)，提示STAT3的阳性表达与下咽鳞癌化疗敏感有关,表达阳性率高

11、者化疗的敏感性较高。 在头颈肿瘤中，53%的患者出现cyclin D1基因扩增,其中下咽鳞癌的发生率较高(P=0.0068) 21,cyclin D1基因扩增患者淋巴结转移早,预后差2224。同时CD1基因扩增者诱导化疗敏感率高(79% vs 31%,P=0.011) 21。Akervall等25也有相同结论(P=0.02)。本研究表明,cyclin D1基因阳性表达率为58.3%(7/12),与上述结果一致。化疗敏感组阳性表达率100%(6/6) 高于不敏感组16.7%(1/6) (P0.05),显示cyclin D1基因高表达与下咽鳞癌化疗敏感性密切相关,作为下咽鳞癌化疗敏感性评估指标之一

12、值得深入研究。 粘蛋白4(MUC4)是存在于细胞膜表面的糖蛋白成分,在上呼吸消化道等肿瘤中均有表达。MUC4通过ErbB2和MAPK信号途径抑制细胞周期进展26，诱导细胞增殖和抑制凋亡27。Weed等28,29认为MUC4和ErbB2基因表达存在相关性，但与下咽鳞癌关系的研究少见。本研究显示MUC4基因表达升高患者对化疗敏感,可以作为潜在评估指标之一。 在上调基因中，代谢酶类基因 (AKAP7、CDKN2A、MMP2等) 较多。其表达异常影响酶活性和细胞代谢,包括加速DDP代谢，降低细胞内药物浓度，导致疗效下降30。下咽鳞癌化疗敏感患者的酶类基因表达升高,影响化疗敏感性的机制尚不清楚,推测可能与其他基因的相互调节或未知的药物作用机制有关。 本研究表明基因表达谱与下咽鳞癌化疗敏感性密切相关,尽管多数上调基因与下咽鳞癌化疗敏感性的关系还不清晰,深入研究将有助于深化对化疗敏感性形成机制的认识,获得评估化疗敏感性的方法,确定个体化治疗方案。 Rogers等31认为EGFR(上皮生长因子受体)信号途径异常与头颈肿瘤的发生和预后密切相关。本研究中，MUC4、integrin、STAT3和MMP2等基因均参与EGFR信号转导。另外，TGF信号途径(TGFBR2、SMAD5等)和Wnt信号途径(Wnt5B、FZD7、PPP2R5C等)基因表达异常,显示