基因克隆及克隆基因的表达

1、LOGO吉林大学白求恩医学院吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室分子生物学教研室 讲讲 师师 孙孙 巍巍Tel: 0431 - 856193692012-10LOGO 一、一、目的目的DNA的分离获取（分）的分离获取（分）分离获取目的分离获取目的DNA有多种方法：有多种方法：(一一) PCR待扩增目的基因两端序列已知待扩增目的基因两端序列已知（据此设计引物）（据此设计引物）(二二) 基因文库基因文库先构建，后筛选先构建，后筛选(三三)化学合成法化学合成法直接合成目的直接合成目的DNA（序列已知、片段较短）（序列已知、片段较短）LOGO 文库法：文库法：一个细胞只接受一个一个细胞只接受一个重组

2、重组DNA分子分子一般一个载体只携带一般一个载体只携带一段外源一段外源DNA 单克隆单克隆LOGO 基因组基因组DNADNA文库（文库（genomic DNA librarygenomic DNA library）：）：包含某一个生物细胞或组织全部基因组包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNADNA序列的随机克序列的随机克隆群体，以隆群体，以DNADNA片段的形式贮存了所有的基因组片段的形式贮存了所有的基因组DNADNA信息。信息。如何从文库中钓取基因？如何从文库中钓取基因？LOGO1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高

3、温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍LOGOPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0 0.1 12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2 2.5u5uMgMg2+ 2+ 1 1.5mmol/L5mmol/LLOGO 二、二、载体的选择与准备（择）；载体的选择与准备（择）；载体（载体（vec

4、torvector）：携带外源）：携带外源DNADNA，实现外源，实现外源DNADNA在受体细胞中在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。 1.按功能按功能克隆载体（克隆载体（cloning vector）表达载体（表达载体（expression vector） 2.按基本元件按基本元件的来源的来源分类：分类：质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体黏粒载体黏粒载体病毒载体病毒载体人工染色体载体等人工染色体载体等LOGO 二、二、载体的选择与准备（择）；载体的选择与准备（择）；（一）根据（一）根据DNA克隆的克隆的目的

5、目的选择与准备适宜载体选择与准备适宜载体1. 获得目的获得目的DNA片段片段选用选用克隆载体克隆载体；2. 获得目的获得目的DNA片段所编码的片段所编码的蛋白质蛋白质选用选用表达载体表达载体。（二）考虑目的（二）考虑目的DNA的的大小大小及受体细胞的种类和来源及受体细胞的种类和来源（三）含有合适的（三）含有合适的MCSLOGO克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖 （一）克隆载体（一）克隆载体（cloning vector）应具备的主要特点应具备的主要特点1.1.至少有一个至少有一个复制起点复制起点（origin of replication, oriorigi

6、n of replication, ori）2.2.至少有一个至少有一个选择性标志选择性标志（selection markerselection marker）3.3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点多克隆位点（multiple multiple cloning sitescloning sites，MCSMCS）4.4.应有较高的拷贝数应有较高的拷贝数pBR322pBR322质粒图谱质粒图谱 LOGO 克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类1.1.质粒质粒(plasmid

7、)(plasmid)是最常用的克隆载体是最常用的克隆载体l广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中l独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构l能在宿主细胞内能在宿主细胞内独立自主复制独立自主复制l带有某些遗传信息带有某些遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些会赋予宿主细胞一些遗传性状遗传性状l质粒的不相容性质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。LOGO 目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳10kb10kb以内

8、的外源以内的外源DNA DNA 。pUC18/19pUC18/19质粒图谱质粒图谱pUC18/19pUC18/19质粒，质粒，2686bp2686bp，是最常用的质粒载体，是最常用的质粒载体缺乏控制拷贝数的缺乏控制拷贝数的roprop基因，因此其拷贝数达基因，因此其拷贝数达500-700 500-700 LOGO T-T-载体：载体：pMD18-T2692bpAmpicillin resistanceoriginHindIIISplnPstIHincIIAccISalIXbalBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRISp6T7LacZTTLOGO 克隆载体用于外源克隆载体用于外源D

9、NA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类2.2.噬菌体噬菌体(phage)(phage)能感染细菌的病毒能感染细菌的病毒（1 1）噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统coscos位点位点: :两端各有一条由两端各有一条由1212个碱基组成、彼此完全互补且个碱基组成、彼此完全互补且55突出的序突出的序列列插入型：插入型：gtgt系列，适用于系列，适用于cDNAcDNA克隆克隆置换型：置换型：EMBLEMBL系列，适用于基因组系列，适用于基因组DNADNA克隆克隆线性双链线性双链DNADNA分子分子coscos12bp12bp48500bpNones

10、sential portionfor replicationLong (left) armShort (right) arm（2 2）M13M13噬菌体噬菌体DNADNA改造系统（含改造系统（含lacZlacZ基因）基因） 单链闭合环状单链闭合环状DNADNA分子分子LOGO 克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类3.3.穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用可在不同宿主细胞中应用人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源人工构建，含有不止一个复制起

11、点，能携带外源DNADNA序列在不同种类序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。宿主细胞中复制、扩增。例如，既能在原核生物中复制例如，既能在原核生物中复制, ,又能在真核生物中复制的载体。又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因），通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表达分析。在酵母菌中用于基因表达分析。LOGO 表达

12、表达载体用于外源载体用于外源DNA的的表达表达 表达载体（表达载体（expression vectorexpression vector）：用来在宿主细胞）：用来在宿主细胞中中表达外源基因表达外源基因的载体的载体 依据其宿主细胞的不同可分为依据其宿主细胞的不同可分为: : 原核原核表达载体（表达载体（prokaryotic expression vectorprokaryotic expression vector） 真核真核表达载体（表达载体（eukaryotic expression vectoreukaryotic expression vector） LOGO 三、目的三、目的DNA与

13、载体连接（接）与载体连接（接）T4DNA ligaseLOGO 四、重组四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）转入宿主细胞进行扩增（转）感受态细胞（感受态细胞（competent cell）：）：处于易于接纳外源物质的状态的细菌处于易于接纳外源物质的状态的细菌LOGO转化转化（transformation） 质粒或黏粒质粒或黏粒细菌细菌 质粒质粒酵母酵母（真核细胞）（真核细胞）转染转染（transfection） 外源外源DNA真核细胞（酵母除外）真核细胞（酵母除外）感染感染（infection） 噬菌体颗粒噬菌体颗粒细菌细菌 病毒颗粒病毒颗粒哺乳细胞哺乳细胞 几个相关概念：几个相关概念：L

14、OGO 将重组将重组DNA转入受体细胞的常用方法：转入受体细胞的常用方法：化学法：化学法： 氯化钙法氯化钙法物理法：物理法： 电击法电击法 显微注射法显微注射法 等等LOGO 五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）1. 抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选2. 蓝白筛选蓝白筛选3. 限制性内切酶法限制性内切酶法4. PCR法法5. DNA测序法测序法主要方法：主要方法：LOGO 五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：无载体转入的细胞无载体转入的细胞dead；含有载体的细胞；含有载体的细胞aliv

15、e。1. 利用利用抗生素抗性标志抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子可筛选出带有载体的重组子尚需进一步鉴定载体是否为含有目的尚需进一步鉴定载体是否为含有目的DNA的重组载体的重组载体LOGOIPTGBlue-white screening of recombinantsLac Operon ?在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）2. 蓝白筛选蓝白筛选 LOGO 3. 限制性内切酶法限制性内切酶法：根据限制酶切图谱筛选特定根据限制酶切图谱筛选特定DNA五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的

16、筛选与鉴定（筛）Linear vector (2700bp)insert (300bp) M 空质粒空质粒 重组质粒重组质粒NcoIHindIII2700bp300bp提取阳性克隆的重组提取阳性克隆的重组DNARE消化消化电泳电泳有无有无DNA片段的插入；片段的插入；插入片段的大小插入片段的大小连接前用什么酶，连接前用什么酶，就用什么酶切就用什么酶切LOGO 可明确序列和阅读框的正确性可明确序列和阅读框的正确性 5. 核苷酸序列测定核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的是最准确的鉴定目的DNA的方法的方法 五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）l利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。

17、利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。l如利用克隆位点两侧序列设计引物进行如利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，能，再结合序列分析，能可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。 4. PCR法法：直接鉴定目的：直接鉴定目的DNA的存在的存在LOGO基因克隆技术基因克隆技术重组蛋白重组蛋白人源抗体人源抗体重组多肽药物重组多肽药物重组疫苗重组疫苗基因克隆基因克隆DNA序列测定序列测定重组载体重组载体基因治疗载体基因治疗载体RNA转录载体转录载体打靶载体打靶载体转基因载体转基因载体基因敲除动物模型基因敲除动物模型转基因动物模型转

18、基因动物模型发夹发夹RNARNAi核酸探针标记核酸探针标记分子杂交分子杂交Southern blotNorthern blot构建文库构建文库基因组文库基因组文库cDNA文库文库基因合成基因合成PCR-克隆克隆-亚克隆亚克隆基因突变基因突变基因克隆技术是分子生物学的核心技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术 LOGO 克克 隆隆 基基 因因 的的 表表 达达 获取重组蛋白获取重组蛋白LOGO亚克隆（亚克隆（Sub cloning）克隆载体克隆载体表达载体表达载体LOGO原核表达系统原核表达系统Prokaryotic expression systemEukaryotic expression

19、system真核表达系统真核表达系统大肠杆菌大肠杆菌酵母酵母昆虫昆虫细胞细胞哺乳动物哺乳动物细胞细胞转化宿主细胞转化宿主细胞Recombinant vectorpromoterTarget geneProteins Transformation/ Transfection LOGO原核表达系统：原核表达系统： 外源基因引入外源基因引入原核原核细胞，使其快细胞，使其快 速高效表达基因产物。速高效表达基因产物。真核表达系统：真核表达系统： 外源基因引入外源基因引入真核真核细胞，细胞，使外源使外源 基因在真核细胞中表达。基因在真核细胞中表达。表达体系表达体系 LOGO第一部分第一部分. .外源基因在

20、外源基因在原核原核细胞中的表达细胞中的表达原核细胞表达原核细胞表达系统组成系统组成二、原核表达载体二、原核表达载体一、原核宿主细胞一、原核宿主细胞Recombinant ProteinLOGO 大肠杆菌大肠杆菌（E.coli)优点：优点：简便简便, , 快速、成本低快速、成本低 可高密度发酵培养可高密度发酵培养20-30min12 hours6-8 Billion bacteriaOnce the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.insulinRecombinant一、原核宿主细胞一、原核宿主细胞注意：

21、注意：用来用来基因和基因和基因的菌株基因的菌株不一样不一样，表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。LOGO生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。达产物。 基因组结构简单，便于基因操作和分析。基因组结构简单，便于基因操作和分析。 多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空不具备真核生物

22、的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。间构象。 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。定性。 原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点： LOGO 二、原核表达载体二、原核表达载体在在原核原核细胞中细胞中表达表达外源基因的外源基因的载体载体。质粒：质粒：噬菌体：噬菌体：最方便，最方便，最常用。最常用。长片段长片段原核表达质粒原核表达质粒LOGO 强启动子强启动子终止子终止子SDSD序列序列1、原核表达质粒的元件：、原核表达质粒的元件：oriPT7SDMCSTerm

23、inatorProkaryotic Expression Plasmid Prokaryotic promoterLac Istart piontAmpicillin resistance克隆元件：克隆元件：表达元件：表达元件：复制原点复制原点插入位点插入位点筛选标记筛选标记LOGO转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。表达载体首先要考虑的问题。 LOGO最理想的最理想的启动子应该是：启动子应该是：早期阶段早期阶段：启动子被阻遏：启动子被阻遏当

24、细胞数目达到一定密度时当细胞数目达到一定密度时：通过诱导使阻遏：通过诱导使阻遏物失活，物失活，RNA聚合酶快速起始转录。聚合酶快速起始转录。 LOGOPlac： 受受Lac阻遏蛋白负调节，阻遏蛋白负调节， 受受IPTG的诱导。的诱导。PL启动子：噬菌体早期启动子：噬菌体早期 左向启动子。左向启动子。 PR启动子：噬菌体早期启动子：噬菌体早期 右向启动子。右向启动子。受受噬菌体噬菌体CI基基因调控因调控 LOGO LOGO成熟型成熟型融合型融合型分泌型分泌型减少原核细胞对外减少原核细胞对外源蛋白的降解源蛋白的降解-天然完整蛋白天然完整蛋白-融合蛋白融合蛋白-分泌性蛋白分泌性蛋白2、原核表达质粒的

25、类型：、原核表达质粒的类型：LOGO 1 1）成熟型表达载体）成熟型表达载体oripromoterSDMCSExpression vectorl 外源基因需携带外源基因需携带ATGATG和和TAATAAl 只表达目的基因编码的只表达目的基因编码的氨基酸氨基酸l 产生天然蛋白，容易被产生天然蛋白，容易被降解，因此降解，因此产量小产量小，也，也可能不稳定。可能不稳定。PForeign DNA LOGO2) 2) 融合型表达载体融合型表达载体载体载体1 1：.ATG .ATG ACGACG TCATCA GATGAT. 载体载体2 2：.ATG .ATG N NACAC GTCGTC AGAAGA

26、T.T. 载体载体3 3：ATG ATG NNNNA A CGTCGT CAGCAG AT.AT.ATGATGNATGNATGNATGNNInsert siteInsert siteInsert site LOGO2) 2) 融合型表达载体融合型表达载体LOGOMost popular prokaryotic expression plasmid with his-tag. 融合型表达载体融合型表达载体举例举例LOGO融合蛋白融合蛋白Ni-affinity chromatography6-hisNiNiHis-his-his-his-his-hisIonic bond His-tag Prot

27、ein可以加入蛋可以加入蛋白酶切位点白酶切位点His taqHis taqTAANcoI (ATG)EcoRIHindIII离子键离子键亲和层析亲和层析LOGO 外源蛋白以融合蛋白的形式表外源蛋白以融合蛋白的形式表达达, 读码框架固定或可选择读码框架固定或可选择 小结小结: 融合型表达载体融合型表达载体表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性 Fusion protein can be purified easily Can be made in large amounts.非天然蛋白，需要表达后切除融合蛋白非天然蛋白，需要表达后切除融

28、合蛋白LOGOSecretion expression vectorsSecreted into medium?(!)E.Coli can not do thatLOGOCell wallCytoplasmic membraneGenome 分泌到细胞周间隙中分泌到细胞周间隙中的重组蛋白质的重组蛋白质Recombinant protein the space between cell membrane and cell wall. LOGOv The recombinant protein will be secreted into periplasmv 避免目的蛋白被细菌蛋白酶降解v The

29、 high expression levelv 利于收集外源蛋白读码框架固定读码框架固定: The target gene does not need start codon because it uses the ATG of signal peptide. LOGO 转化平板转化平板Recombinant Protein三、外源基因在三、外源基因在E.coli中的表达中的表达LOGOIPTG additionQuantity of target protein in cell, units LOGO Where your expressed protein will be located?

30、 Inclusion bodies (insoluble) Cytoplasm (soluble)Secreted into periplasmatic space(soluble or insoluble) NothingRecombinant protein may be hydrolyzed by proteinasesresistant to proteinase hydrolysis that results in the high yield LOGO Purify and Identify the protein问题：问题：是不是所有基因都可以在是不是所有基因都可以在E.coli

31、中表达？中表达？LOGO 删除内含子和删除内含子和5非编码区非编码区 外源基因置于强启动子和外源基因置于强启动子和SD顺序控制下顺序控制下 维持正确开放阅读框架（维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解不被降解1.蛋白不需要翻译后加工过程蛋白不需要翻译后加工过程 LOGO真核基因在真核基因在E.coliE.coli中表达应该如何构建？中表达应该如何构建？（1 1）基因片段应该来源于）基因片段应该来源于mRNAmRNA，因，因为为E.coliE.coli不能对基因进行剪接。不能对基因进行剪接。真核基因真核基因原核基因原核基因断裂

32、断裂基因基因连续连续基因基因采用采用RT-PCR法法 LOGO（2 2）尽量将密码子改变成）尽量将密码子改变成E.coliE.coli偏爱密码子，如偏爱密码子，如果有困难，可尝试将基因果有困难，可尝试将基因55端前端前5050个碱基变成偏个碱基变成偏爱密码子。爱密码子。 E.ColiE.Coli 核糖体蛋白质的密码子使用频率：核糖体蛋白质的密码子使用频率：LOGO Case 1.Case 1. hIFN- hIFN- 2b2b的表达的表达hIFN-hIFN- 2b2b的特点：的特点：1 1）一级结构发挥作用，不需要翻译后加工）一级结构发挥作用，不需要翻译后加工2 2）经过密码子的改造可以在）经

33、过密码子的改造可以在E.coliE.coli中高效表达中高效表达LOGOCase 2.Case 2. HBsAg HBsAg的表达的表达HBsAgHBsAg的特点：的特点：1 1）高度糖基化）高度糖基化E.ColiE.Coli没有蛋白质没有蛋白质加工修饰功能，即加工修饰功能，即使表达出蛋白质也使表达出蛋白质也不具备天然蛋白质不具备天然蛋白质的功能。的功能。2 2）HBVHBV是真核病毒，因此是真核病毒，因此HBsAgHBsAg基因含有基因含有E.coliE.coli的稀有密码子。的稀有密码子。因此，到目前为止，因此，到目前为止，HBsAgHBsAg重组疫苗还是在重组疫苗还是在真核真核CHOCH

34、O细胞或酵母中表达的。细胞或酵母中表达的。 LOGO 真核表达系统的必要性及优势：真核表达系统的必要性及优势：1. 具转录后加工系统具转录后加工系统2. 具翻译后修饰系统，重组蛋白具有很好的活性具翻译后修饰系统，重组蛋白具有很好的活性3. 可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达4. 基因治疗、研究基因的功能等基因治疗、研究基因的功能等 原核表达系统的缺点：原核表达系统的缺点：1. 没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子 2. 缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工一步修饰加工 LOGO 真核细胞真

35、核细胞酵母细胞酵母细胞昆虫细胞昆虫细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞酵母表达系统酵母表达系统昆虫表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞哺乳动物细胞表达系统表达系统以获得大量的有活以获得大量的有活性的蛋白为目的性的蛋白为目的研究基因或其蛋白质研究基因或其蛋白质产物的功能为目的产物的功能为目的第二部分第二部分.外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达YeastInsectMammalianEukaryotic Expression SystemLOGO 一、酵母表达系统一、酵母表达系统系统组成：系统组成： 酵母细胞酵母细胞 酵母质粒表达载体酵母质粒表达载体比细菌菌落大而厚，菌比细菌菌落大而厚，菌落

36、表面光滑湿润、粘稠、落表面光滑湿润、粘稠、容易挑起，容易挑起，质地、颜色均一，质地、颜色均一，多为乳白色多为乳白色* *低等真核单细胞生物，生长快，可大规低等真核单细胞生物，生长快，可大规模发酵培养模发酵培养, , 成本较低。成本较低。* *可以进行一定程度的蛋白质翻译后修饰。可以进行一定程度的蛋白质翻译后修饰。1.1.酵母细胞：酵母细胞：LOGO 大肠杆菌大肠杆菌/酵母菌穿梭载体酵母菌穿梭载体 ：1. 在在E.coli中复制与筛选中复制与筛选 *pUC ori , Ampr2. 在酵母细胞象细菌中质粒一样复制在酵母细胞象细菌中质粒一样复制（2u origin）3. 在酵母细胞中表达外源基因在

37、酵母细胞中表达外源基因 *酵母可识别的启动子酵母可识别的启动子4. 筛选标记：筛选标记： 营养缺陷筛选营养缺陷筛选 URA32. 2. 酵母质粒表达载体酵母质粒表达载体LOGO 二、昆虫表达系统二、昆虫表达系统昆虫病毒：昆虫病毒：baculovirus转递质粒载体转递质粒载体1 1、可对蛋白质进行、可对蛋白质进行翻译后加工修饰翻译后加工修饰2 2、可、可高水平表达高水平表达外源基因产物外源基因产物3 3、操作相对简单、操作相对简单-已经商品化已经商品化4 4、蛋白准确定位、蛋白准确定位-如分泌到膜外。如分泌到膜外。载体：载体：昆虫表达系统的组分：昆虫表达系统的组分：昆虫细胞昆虫细胞 优点：优点

38、：LOGO病毒基因组相病毒基因组相对较对较大大，不宜，不宜直接将外源基直接将外源基因克隆到病毒因克隆到病毒基因组。基因组。- the polyhedrin gene becomes unnecessary. -replace polyhedrin coding seq with gene of interest (G of I)Baculovirus genomestrong PromoterPolyhedrin gene昆虫病毒昆虫病毒昆虫表达载体：昆虫表达载体：提供目的基因的质粒载体提供目的基因的质粒载体昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒. LOGO * *首先将外源片段克隆到某质粒上，再以某种机制

39、首先将外源片段克隆到某质粒上，再以某种机制将外源片段递到病毒基因组上将外源片段递到病毒基因组上有两种不同原理构建的昆虫表达系统：有两种不同原理构建的昆虫表达系统：1）根据）根据原理构建的原理构建的2）根据）根据原理构建的，原理构建的，如如Bac-To-Bac表达系统表达系统昆虫表达载体：昆虫表达载体：提供目的基因的质粒载体提供目的基因的质粒载体LOGO -转座子机制：如转座子机制：如Bac-To-Bac表达系统表达系统Bacmid - insect cellBacmidPolyhedrin promoter将转座子的靶点构建到昆虫病毒基因组上将转座子的靶点构建到昆虫病毒基因组上（Baculov

40、irus plasmid） 带有杆状病毒基因组带有杆状病毒基因组的质粒，的质粒，可在细菌和昆虫细胞可在细菌和昆虫细胞之间穿梭之间穿梭 LOGO 是否还记得转座子是在染色体间运动？是否还记得转座子是在染色体间运动？123456789123456789987654321987654321Transposase geneATGCATACGTTarget siteHost DNAtransposaseATGCATACGTtranspositiontransposonATGCATACGTATGCATACGT123456789123456789987654321987654321TransposonTar

41、getrepeatsInverted repeatsInverted repeatsTargetrepeats转座子转座子(trans-poson,Tn)是存在于染色体是存在于染色体DNA上可自主复制和位上可自主复制和位移的基本单位。可在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动移的基本单位。可在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列。序列。 LOGO * *将转座子的两个臂构建将转座子的两个臂构建到到MCSMCS两侧。两侧。1.构建重组转递质粒构建重组转递质粒* *通过基因克隆的方通

42、过基因克隆的方法将法将外源片段外源片段克隆到克隆到转递质粒上。转递质粒上。庆大Ppolh真核筛选标记基因真核筛选标记基因 promoter of Polyhedrin G of I are flanked with two arms of a transposon.LOGO 2 Recombinant bacmid DNA主要是主要是LacZ , Kanr , oriE Baculovirus genome pFastBac1Tn7LPpolhForeign geneAttachment sitehelperCompetent DN10Bac E.coliTransformationhelpe

43、rForeign genePpolhE.coli containing recombinant BacmidPpolhMini-prep of high molecular weight DNA2. To construct recombinant Bacmid DNA based on transposition mechanism in E.coli.1 Recombinant donor plasmidHelper质粒编码转座酶TetramprTn7RTet Kan , 庆大 Blue-White selection 庆大Transposition Bacmid（23天）天）LOGOIs

44、olated recombinant bacmid DNAthen transfect insect cells with lipo-insect4. Viral amplyfication: harvest the supernatant and infect insect cells for 5times5. recombinant protein: Expressed by insect cells is in supernantant while viral amplificates. 3. Bacmid will be packaged into viral particle in

45、insect cell. Reconbinant baculoverus particle is released into the supernatant. Infect other cell.Recombinant bacmid particles LOGO感染前感染前感染后感染后 LOGO三、哺乳动物细胞表达系统三、哺乳动物细胞表达系统系统组成：系统组成：宿主细胞：哺乳动物细胞宿主细胞：哺乳动物细胞* 表达最接近天然的重组蛋白质表达最接近天然的重组蛋白质* 重组蛋白的产量较低重组蛋白的产量较低* 直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能* 可用于基因治疗可用于

46、基因治疗表达载体：表达载体：* 哺乳动物细胞质粒表达载体哺乳动物细胞质粒表达载体* 动物病毒动物病毒 LOGO 哺乳动物细胞质粒表达载体哺乳动物细胞质粒表达载体eukaryoticMCSPoly A signalterminatorNeorLOGO 酵母细胞酵母细胞昆虫细胞昆虫细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞质粒质粒昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒质粒或病毒质粒或病毒重组蛋白质产物重组蛋白质产物:产率产率翻译后修饰翻译后修饰活性活性载体载体目的基因目的基因优选优选cDNA 真核细胞表达系统的比较真核细胞表达系统的比较 Yeast system limited post-translational modifications grow readily in simple mediumLOGO克隆基因的表达克隆基因的表达获取重组蛋白获取重组蛋白 表达体系表达体系 载体载体 宿主宿主原核生物表达体系原核生物表达体系 质粒、噬菌体质粒、噬菌体 细菌细菌酵母表达体系酵母表达体系 穿梭质粒穿梭质粒 酵母酵母昆虫细胞表达体系昆虫细胞表达体系 昆虫病毒昆虫病毒 昆虫细胞