尿红细胞THP免疫细胞化学染色确定血尿来源

1、    尿红细胞THP免疫细胞化学 染色确定血尿来源        摘要收集48例有明确诊断的血尿患者新鲜尿标本，用SP免疫细胞化学染色法检测尿红细胞上被覆的Tamm-Horsfall蛋白(THP)以鉴别肾小球性血尿和非肾小球性血尿。结果显示在22例肾小球性血尿中20例染色阳性(90.9%)，而在26例非肾小球性血尿中只有3例染色阳性(11.5%)，两者差异有高度显著性(P0.001)。认为尿红细胞THP免疫细胞化学染色法是一种确定血尿来源的可靠新方法。关键词血尿T

2、amm-Horsfall蛋白免疫细胞化学Immunocytochemical staining of erythrocytes in urine for tamm-horsfall protein in the differentiation of nonglomerular from glomerular hematuriaLuo Guangchen, Na Yanqun, Xia Tongli, et al. Department of Urology, Xiamen Zhongshan Hospital, Xia men 361004AbstractFresh urine samples

3、 were collected from 48 patients who have had hematuria with clinical di-agnosis already established. Stretaviden/Peroxidase immunocytochemical stai-ning was used for Tamm-Horsfall protein (THP) coating the erythrocytes in urine to discriminate glomerular and nonglomerular hematuria. Results showed

4、that 20 samples of 22 glomerular hematurias were stained positively (90.9%), while only 3 samples of 26 nonglomerular hematurias were positive (11.5%). It revealed that the immunocytochemical stai-ning of urinary erythrocytes for Tamm-Horsfall protein appears to be a reliable method to differentiate

5、 glomerular from glomerular hematuria (P0.001).Key wordsHematuria Tamm-Horsfall protein Immunocytochemistry血尿按来源可分为肾小球性血尿和非肾小球性血尿，两种血尿的鉴别对病因诊断有很大帮助。肾小球来源的尿红细胞表面被覆Tamm-Horsfall蛋白(THP)，而非肾小球来源的尿红细胞表面则没有，应用THP抗体免疫标记技术检测THP来鉴别肾小球性血尿和非肾小球性血尿，具有客观性强，敏感性和特异性高的优点13。但文献研究中所用的免疫标记技术不常用，使其临床应用受到一定的限制。我们采用临床病理免

6、疫染色中常用的SP法检测尿红细胞THP免疫染色确定血尿来源的可能性，以利于临床更好地推广应用。临床资料选择自1996年11月1997年4月在北京医科大学第一医院泌尿科和肾内科住院的血尿患者48例，经尿常规分析，证实有真性肉眼或镜下血尿。分二组：(1)肾炎组22例。男性8例，女性14例。年龄1557岁，平均年龄29岁。其中肾小球肾炎17例，狼疮性肾炎5例，均有肾脏穿刺病理结果。(2)肾后泌尿生殖道疾病组26例。男性19例，女性7例。年龄2887岁，平均年龄54岁。其中泌尿系结石11例(肾结石7例，输尿管结石4例)有可靠的影像学证据，大多得到结石并作成分分析；肾盂癌2例，膀胱癌8例，膀胱炎1例，膀

7、胱结核1例，前列腺增生2例，前列腺导管腺癌1例，均有手术或活检病理结果。方法一、主要试剂兔抗人THP抗体(中国原子能公司)，免疫组化染色SP试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。二、主要方法取新鲜尿标本1030ml，以2 000r/min离心10分钟，弃去上清液，滴加少许PBS缓冲液重新混悬，取一滴混悬液于载玻片上，自然风干后，以冷丙酮固定10分钟，然后染色。1%过氧化氢阻断内源性过氧化物，室温15分钟；10%正常羊血清封闭非特异性染色，室温20分钟。然后，加入兔抗人THP抗体，室温下孵育1小时；滴加生物素标记的羊抗兔IgG，室温下孵育30分钟；滴加辣根酶标记的链霉卵白素，室温下孵育1小时；DA

8、B显色510分钟。最后苏木精复染，封片镜检。在每次染色过程中均有肾小球性血尿和非肾小球性血尿病例，并设置以PBS缓冲液代替THP抗体的抗体替代对照。三、结果判定在显微镜下计数观察红细胞不少于50个，阳性细胞呈棕黄色，而阴性细胞不着色。着色红细胞70%判定为肾小球性血尿，着色红细胞30%为非肾小球性血尿，介于二者之间的为混合性血尿3。统计学分析：采用SPSS统计软件，计数资料2检验。结果在22例肾小球性血尿中，有20例染色与临床诊断符合(90.9%)，2例不符，这2例的肾穿病理分别为型膜性肾病和局灶性阶段性肾小球硬化。在26例非肾小球性血尿中，有23例染色与临床诊断符合(88.5%)，3例不符，

9、这3例的临床诊断分别是：肾结石1例，膀胱癌1例，前列腺导管腺癌1例。两组结果经2检验，差异有高度显著性(P0.001)。尿红细胞THP免疫细胞化学染色鉴别肾小球性血尿和非肾小球性血尿的灵敏性、特异性和总符合率分别为90.9%、88.5%、89.6%。讨论无症状血尿，特别是无症状镜下血尿，经一些常规的检查手段难以明确病因，这时做尿红细胞定位检查有重要意义。目前常用的定位诊断方法是尿红细胞形态检查，即红细胞位相。这种检查方法受尿样的影响较大，并有较大的主观性，有一组双盲对比试验表明，两位有经验的观察者可有38%的判定误差4，5，使临床应用受到一定的限制。THP是肾小管髓袢升支粗段和远曲小管近段上皮

10、细胞分泌的一种大分子糖蛋白，作为尿中含量最多的蛋白质，具有重要的生理功能，并参与许多疾病的病理过程。1987年，Abrass等1用免疫荧光标记THP抗体，发现肾小球来源的尿中游离细胞(包括红细胞、白细胞、上皮细胞等)被覆有THP。并作为鉴别肾小球疾病和非肾小球疾病的有效方法。其理论依据是肾小球来源的尿游离细胞经过肾小管，从而被覆了一层THP。实验中证实以含THP丰富的尿液或其它液体孵育红、白细胞并不能使它们被覆上THP。关于其被覆机制目前尚未完全明了。Rindler等6通过转基因细胞，证实THP以磷脂酰肌醇与肾小管上皮细胞的细胞膜紧密连接，由于磷脂酶或蛋白酶的作用而释放。近来，有作者转换角度，

11、单纯通过检测尿THP包被红细胞来确定血尿的来源，使Abrass等的发现有了新的应用价值2，3。他们以免疫酶标技术代替免疫荧光技术，使敏感性大大提高。本研究选择了目前临床病理免疫染色工作中常用的SP染色法。这种方法具有灵敏度高、特异性强以及背景清晰、成本低廉的优点，更有利于临床推广应用，取得了满意的结果。文献中所有的肾小球性血尿均为阳性结果，符合临床诊断，而本组22例中有2例阴性(9.1%)，这可能与染色技术有关，也可能与这2例尿红细胞上被覆的THP太少有关。26例非肾小球性血尿中，有3例不符，其中2例结果判定为混合性血尿，1例判定为肾小球性血尿，与文献结果类似。我们认为，在BPH和肾结石中有少

12、部分呈混合性血尿或肾小球性血尿，这是由于它们引起肾脏损伤或肾功能损害的缘故。尿细胞THP免疫细胞化学染色是鉴别肾小球性血尿和非肾小球性血尿的一种可靠方法，虽然在应用之前尚需要做更大规模的临床验证和建立标准，但相信它有很好的应用前景。参 考文献1Abrass CK, Laird CW. Tamm-Horsfall protein coating of free cells in urine. Amer J Kidney Diseases, 1987,994-97.2Janssens PM, Komaat N, Ticleman R, et al. Localization the site of

13、 hematuria by immunocytochemical staining of erythrocytes in urine. Clin Chem,1992,38216-222.3Fukkuzaki A, Kaneto H, Ikeda S, et al. Determining the origin of hematuria by immunocytochemical staining of erythrocytes in urine for Tamm-Horsfall protein. J Urol,1996,155248-251.4Goldwasser P, Antignani A, Avran MM. Effect of urine chemistry on red cells. Nephron, 1991,59328-329.5Raman GV, Pead L, Lee HA, et al. A blind control trial of phase contrary by two observers for evaluation the