人参二醇皂苷对重症胰腺炎急性肺损伤时水通道蛋白表达的影响

1、人参二醇皂苷对重症胰腺炎急性肺损伤时水通道蛋白表达的影响作者：赵航 陈光 王贵民 孙东辉 张永喜 赵雪俭 谭毓铨 作者单位：(吉林大学第一医院普外科，吉林 长春 130021)【摘要】 目的 探讨人参二醇皂苷(panaxadiols，PDS)对急性重症胰腺炎(SAP)急性肺损伤时的水通道蛋白(AQP1)影响。方法 Wistar大鼠随机分为假手术组(SO组)、SAP组、地塞米松组(DEX组)和PDS组，每组8只。SAP组、DEX组和PDS组大鼠胰管逆行注射5%牛磺酸黄制备大鼠胰腺炎模型;SO组手术操作同其他组，但不向胰管内注射5%牛磺酸钠。制模成功后DEX组腹腔注入DEX，剂量为0.5 mg/1

2、00 g;PDS组腹腔注入PDS，剂量为2.5 mg/100 g。模型制作6 h后杀鼠，测定血清淀粉酶、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL6)，肺脏湿/干重比值;应用RTPCR测定肺脏AQP1 mRNA的水平，应用蛋白印记杂交方法观察AQP1蛋白改变情况。结果 应用PDS治疗后AQP1在mRNA和蛋白水平均有所增加，减轻了肺水肿、肺损伤。结论 在SAP时应用PDS可以抑制TNF、IL6表达，减轻血液浓缩，改善微循环，增加肺组织水通道蛋白1的表达，从而减轻肺水肿、肺损伤。【关键词】 水通道蛋白;急性重症胰腺炎;急性肺损伤急性重症胰腺炎常合并肺水肿、肺损伤，肺脏水通道蛋白(aquapori

3、n1，AQP1)表达减少，在 mRNA水平和蛋白表达水平均有明显下降，说明AQP1表达的减少在急性胰腺炎肺水肿发生中起了重要作用1，地塞米松通过抑制炎症反应介质、提高水通道蛋白表达等改善SAP肺损伤2。PDS对应激状态下的细胞膜及细胞器有较强的保护作用，促进细胞DNA的合成和损伤后的修复，促进细胞有丝分裂加快增殖和生长速度，抑制细胞凋亡。人参皂苷具有抗休克、保护细胞膜、增加清除氧自由基的功能，在休克、缺血等方面的实验中发现其具有和糖皮质激素相同的作用，达到保护细胞，细胞器的功能，促进LPS休克大鼠肺组织AQP1表达。本实验旨在探讨在胰腺炎治疗中应用PDS的效果。1 材料与方法1.1 材料 Wi

4、star 大鼠，体重200250 g，雄雌不限，购自吉林大学实验动物中心;牛磺胆酸钠购自Sigma公司。RNAoutTM购自华氏生物公司;TNF、IL6放免检测试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。抗大鼠AQP1抗体由美国加州大学旧金山医学院杨宝学教授惠赠，PDS由吉林大学基础医学院天然药物研究室提供。1.2 模型制备 大鼠适应性饲养1 w。术前12 h禁食、不禁水。随机分为SAP组、假手术(SO)组、地塞米松(DEX)组和PDS组，每组8只。SAP组乙醚浅麻醉后，上腹部正中切口长约1 cm入腹;找到十二指肠侧壁胰胆管汇合膨大处，用四号针头(平面朝上)穿刺，成功后向胆总管内进入约56 mm

5、，用无创小血管夹于肝门侧暂时阻闭肝门侧胆管;向胆胰管内逆行匀速注入5%牛磺胆酸钠(剂量为0.1 ml100 g-1min-1);10 min后去除动脉夹，关腹。SO组手术操作方法同SAP组，但不向胰管内注入牛磺胆酸钠。DEX组在制模成功后，腹腔内注入DEX，剂量为0.5 mg/100 g。PDS组在制模成功后，腹腔内注入PDS，剂量为2.5 mg/100 g。各组动物于手术结束后皮下注射0.9%氯化钠2 ml，以补充丢失的水分。于造模6 h后杀鼠。经下腔静脉采取5 ml血，离心(3 000 r/min，3 min)，取上清，-20冻存。取左肺测定肺湿重/干重比，右肺取出一部分立即10%甲醛固定

6、，行组织学观察。其余部分立即冻存于液氮中，-80冰箱中保存。1.3 血清淀粉酶、白蛋白、红细胞压积、TNF、IL6测定 应用自动生化分析仪测定血清中淀粉酶(AMS)和血清白蛋白，红细胞压积采用流式细胞仪检测，应用TNF、IL6放免检测试剂盒采用放免法检测血清TNF、IL6水平。1.4 肺湿/干重比值测定、组织学观察 杀鼠后取左叶肺组织测定湿重，90烘烤48 h后，测定干重，测定湿/干重比值。固定后的肺组织常规切片、HE染色后镜下观察。1.5 肺组织AQP1mRNA表达 采用RNAoutTM按照操作说明提取肺组织总RNA，并检测纯度及完整性。在100 l 逆转反应体系中加入5 g大鼠肺组织 RN

7、A，逆转录合成及纯化cDNA。行RTPCR：AQP1引物序列：5ATGGCCAG CGAGTTAAAGAAGA3，反向引物：5TTTGGGCTT CATCTCCACCCTG3。 扩增的条件：94变性3 min;94变性30 s,58退火30 s,65延伸1 min,30循环;最后72延伸5 min。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。凝胶成像仪记录、分析。1.6 肺组织AQP1蛋白表达 取肺组织100 mg,加入0.9 ml蛋白提取液，4下反复离心提取膜蛋白。测定膜蛋白浓度。取蛋白质15 g，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用电转仪将蛋白转移到硝酸纤维素(PVDF)膜上，然后行免疫印迹

8、：将兔抗鼠AQP1抗体1500稀释溶于TBST，室温孵育60 min，加入12 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗。室温孵育60 min。加入NBTBCIP显色液显色，Stop Buffer终止染色。特异性条带的光密度值采用GIS图像分析系统处理。1.7 统计学方法 各组数据用xs表示，应用EXCEL工作表t检验进行统计处理。2 结果2.1 血清淀粉酶、TNF、IL6、红细胞压积、肺湿/干重比值测定和组织学观察 重症胰腺炎模型制作6 h后血清炎症介质TNF、IL6均有显著升高。PDS组、DEX治疗组血清中炎症介质TNF和IL6减少，肺组织中含水量减少，肺水肿减轻，血液浓缩情况有所改善

9、。见表1。镜下观察到SAP组大鼠肺组织细胞腔扩大、肺泡壁断裂，有的出现肺大泡，肺泡内伴有渗出及少量肺出血，肺组织可见炎细胞浸润。应用DEX、PDS后肺组织水肿及组织炎细胞浸润减轻。2.2 AQP1mRNA在肺组织中的表达 急性重症胰腺炎肺损伤模型制作6 h后，肺组织内水通道蛋白AQP1 mRNA表达有所减少。应用PDS、地塞米松后表达有所增加。见图1。表1 不同实验组大鼠血清淀粉酶、肺湿/干重比值、血清TNF、IL6、白蛋白、红细胞压积对比(略)与SO组比较：P0.05，2)P0.01;与SAP组比较：3)P0.05，4)P0.012.3 AQP1蛋白在肺组织中的表达 重症胰腺炎肺损伤模型制作

10、成功后6 h后，水通道蛋白1表达有所减少，与AQP1mRNA表达相一致。应用地塞米松、PDS后AQP1表达有所增加。见图2。图1 AQP1mRNA在肺组织中的表达(RTPCR)(略)图2 AQP1蛋白在肺组织中的表达(蛋白印记杂交)(略)3 讨论ARDS是重症胰腺炎常见而严重的并发症之一，血清炎症介质IL6、TNF释放增加，参与SAP后急性肺脏损伤，加之SAP后血清白蛋白减少，加重肺水肿形成，大量液体渗出到第三间隙后造成血液浓缩(红细胞压积升高)，进一步造成组织循环障碍、缺血缺氧，加重肺脏功能损害。研究发现，肺脏水通道蛋白AQP1表达减少，在 mRNA水平和蛋白表达水平均有明显下降，说明水通道

11、蛋白AQP1表达的减少在急性胰腺炎肺水肿发生中起了重要作用。应用DEX可以抑制炎症介质的释放、抑制NFB的表达及核迁移，在mRNA和蛋白水平上增加了AQP1的表达，减轻了重症胰腺炎所致的肺水肿、肺损伤，说明水蛋白表达的减少参与SAP急性肺损伤的发生1，2。可能与AQP1启动子中糖皮质激素反应元件相关3，4。PDS对应激状态下的细胞膜及细胞器有较强的保护作用。促进细胞DNA的合成和损伤后的修复，促进细胞有丝分裂加快增殖和生长速度，抑制细胞凋亡。人参皂苷具有抗休克、保护细胞膜、增加清除氧自由基的功能。在休克、缺血等方面的实验中发现其具有和糖皮质激素相同的作用，达到保护细胞，细胞器的功能，促进LPS

12、休克大鼠肺组织AQP1表达5。本研究中应用人参二醇皂苷减少炎症介质IL6、TNF释放，通过减轻红细胞浓缩、减轻组织器官水肿、改善微循环，增加肺组织水通道蛋白表达，减轻肺水肿及肺损伤。人参二醇皂苷没有糖皮质激素免疫抑制等副作用，具有在临床治疗中替代糖皮质激素的潜能。在重症胰腺炎肺损伤治疗中应用PDS可以抑制炎症反应，促进水通道蛋白表达，达到减轻肺水肿、肺损伤的作用。【参考文献】1 王贵民，王银萍，赵雪俭，等.AQP1蛋白在重症胰腺炎急性肺损伤中的表达J.中华普通外科杂志，2006;21(4)：3012.2 王贵民，所 剑，王忠义，等.地塞米松对重症胰腺炎急性肺损伤时水通道蛋白表达的影响J.中华普通外科杂志，2007;22(2)：1578.3 King LS，Nielsen S，Agre P.Aquaporin1 water channel protein in lung：ontogeny，steroidinduced expression，and distribution in ratJ.