质粒DNA的提取-郑小煜

1、质粒DNA的提取、纯化和检测姓名：郑小煜学号：201100140069班级：2011级生技班组别：第二组同组者：赵莉、高瑞一、 实验目的1、 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2、 掌握碱变性提取法提取质粒DNA的方法。3、 学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。4、 掌握凝胶的观察方法，并学会分析。二、 实验原理1、 质粒(plasmid)l 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,为双链、闭合环状的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。l 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。l 质粒的存在使宿主细胞具

2、有一些额外的特性，如 对抗生素的抗性等。l 质粒在细胞内的复制一般有两种类型：严紧控制型（Strengent control）：复制受宿主细胞的严格调控，拷贝数低；松弛控制型（Relaxed control）：复制不受宿主细胞的调控，拷贝数高，适用于基因工程中做载体。2、 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，

3、主要适用于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可以用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及链接反应等。3、 碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。4、 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在，细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.

4、0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离.当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中; 但染色体DNA 不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒

5、DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚氯仿抽提除去，苯酚、氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起到消除抽屉过程中出现的泡沫。再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以除去残留的氯仿。然后用75%以纯溶液洗涤沉淀，一出去残留的盐离子。最后获得纯度较高的质粒DNA贮存在TE溶液中，-20保存。5、 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中

6、，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。   6、 凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验.7、 分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)

7、和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5500bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。琼脂糖加热至90左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，

8、其凝固点为40-45。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。8、 琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。核酸在溶液中由于它们有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁速率主要取决于下面6个因素：（1） 样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量（所含碱基）的对数值成正比，

9、这是因为大分子有更大的摩擦阻力。（2） DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA（open circle DNA，ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA（liner DNA，L DNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环分子。（3） 琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片

10、段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。（4） 电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。（5） 缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水（如不慎误用去离子水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒涌动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错

11、用10*电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至融化凝胶或使DNA变性。 电泳时常用的缓冲液有乙酸盐(TAE)、硼酸盐(TBE)和磷酸盐(TPE)几种不同的电泳缓冲液，通常配成10×或5×的浓缩母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。电泳缓冲液的工作浓度约50 mmolL，工作pH在7578之间。TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能力逐渐丧失(阳极变碱性，阴极变酸性)，长时间电泳需要更换缓冲液；TBE、TPE缓冲液缓冲能力较强，可以重复使用数次。TAE缓冲液可以分离数kb长度的DNA，在精制DNA片段以及染色体DNA进行杂交时比较常用。相反，TB

12、E缓冲液适于鉴定、分离短小的DNA片段。（6） 温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4-30°C内无变化,一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行,而当琼脂糖含量少于0.5%时,凝胶很脆弱,最好在4°C下电泳以增加凝胶强度。9、 DNA分子量MarkerSupercoiled DNA Ladder Marker(浓度 : 500 ng/ 6l )Supercoiled DNA Ladder Marker 由 8种超螺旋的质粒DNA 构成，DNA Size大小分别为: 2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8

13、,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中2 kbp6 kbp间约以1 kbp递增，6 kbp12 kbp间约以2 kbp递增。每次取6 l 电泳时，每条带的DNA量约为50 ng，其中5 kbp条带的DNA量约为其他条带的3倍 (150 ng)，显示亮带。此DNA 溶液中已含有1 ×Loading Buffer，可直接上样。1 × Loading Buffer中含有色素Xylene Cyanol FF (0.01%) 以及Bromophenol Blue (0.01%)。 三、 主要仪器和材料试剂1、 仪器和材料 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡

14、器，水浴锅，1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头、微量移液枪，平板，接种环，酒精灯，量筒，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管，记号笔等。2、 菌体 E.coli DH5受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19。试剂 LB培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Hcl，10mmol/LEDTA），溶液（0.2mol/L NaOH,1%SDS，现配现用），溶液（5mol/LKAc 60ml,冰醋酸11.5ml，重蒸水28.5ml），RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混

15、合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭(EB), DNA相对分子质量标准物DNA Marker kHind，5 molL pH 52的醋酸钠，无水乙醇。四、 实验步骤（一） 涂布平板1、 配制2瓶LB培养基。2、 1瓶LB中加氨苄，另一瓶不加氨苄。分别倒平板。3、 两个平板均分为2半，一半涂布携带有质粒pUC19的E.coli菌落，另一半涂布不携带有质粒pUC19的E.coli菌落。4、 37°C培养。（二） 细菌培养1、 在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取携带有质粒pUC19的E.co

16、li单菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。2、 将过夜培养物以2%接种量接种到50ml含有氨苄青霉素（终浓度80-100g/mL）的LB液体培养基中，37°C160r/min振荡培养过夜或至对数生长晚期。（三） 质粒DNA提取1、 取30mL菌液于50mL灭菌离心管中，4°C 6000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌体细胞。（事先称量50mL离心管的重量W1=14.54g）2、 将菌体沉淀悬浮于5mL用冰预冷的溶液I中，用旋涡振荡仪混匀，7000r/min离心5min，弃去上清液，将离心管倒置，使上清液全部流尽，称量菌

17、体质量W2=14.67g，即得菌体湿重W=W2-W1=0.13g。3、 按湿菌体质量：溶液I体积=100mg：1mL的比例加入用冰预冷的溶液I（约为2mL），剧烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于冰上5min。4、 以2倍溶液I的体积加入新配置的溶液II（约为4mL），慢慢颠倒使之混匀（切勿剧烈震荡！），将离心管置于冰上5min，此时溶液变粘稠如蛋清状。5、 以1.5倍溶液I体积量加入用冰预冷的溶液III（约为3mL），慢慢颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上5min，此时有白色絮状沉淀物。6、 4°C 12000r/min离心15min，将上清液（约为8

18、.5mL）转移到另一洁净离心管中。7、 向上清液中加入1/10体积的3mol/L KAc（约为850L），再加入2倍体积的无水乙醇（约为17mL），混匀，-20°C下静置30min，沉淀DNA。8、 4°C 12000r/min离心15min，小心倒去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。9、 向DNA沉淀中加入70%冰乙醇5mL，4°C 12000r/min离心5min（注意：离心管底部DNA沉淀物所在面应与收集沉淀方向一致），去掉上清液，将离心管倒置于纸巾上，室温干燥。10、 将DNA沉淀溶于1mL TE缓冲液中，加入RNase A（10mg/mL）

19、，终浓度为50g/mL。37°C 保温1-2h。（四） 质粒DNA的纯化1、 将上述DNA溶液平均分装于2个1.5mL微量离心管中，没管为0.5mL，分别加入等体积的饱和酚，旋涡振荡30s，12000r/min离心5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中。2、 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，旋涡振荡30s，12000r/min离心5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中。3、 加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，旋涡振荡30s，12000r/min离心5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中。4、 加入1/10体积3mol/L KAc（pH4.6），混匀，再加入2倍体积的无水乙

20、醇，混合均匀，于-20°C下沉淀DNA 20min。5、 4°C 12000r/min离心15min，收集沉淀DNA。6、 在沉淀的DNA中，加入70%乙醇500L，4°C 12000r/min离心2min（注意：离心管底部DNA沉淀物所在面应与收集沉淀方向一致），小心倒去上清液，将离心管倒置于纸巾上，使所有液体流出，室温干燥。7、 重复洗涤一次，吸弃上清，37°C风干5min。8、 用30L TE缓冲液重新溶解DNA，温和振荡几秒钟，放置-20°C下保存。（五） DNA纯度检测(凝胶电泳)1、 取40mLTAE（1×）于300mL锥

21、形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微波炉内加热3min使其熔化.2、 待凝胶温度降至大约60°C(手持杯子不烫手,即感觉热但能握得住)时,倒入准备好的制胶板中，插入梳子，梳齿位置在托盘底面上的0.5-1.0mm处。3、 待胶冷却后拔出梳子。拇指和食指轻移胶板的两侧，放入电泳槽中，倒入1×TAE缓冲液，没过胶2-3mm,梳孔在黑线上。4、 取纯化的质粒样品2L、上样缓冲液1L和水2L(先加)混合，点样于梳孔中。同时在胶上点样合适的DNA Marker。图1 凝胶电泳点样顺序及上样量5、 盖好电泳槽盖子，选择适当的电压和方向，开始电泳。本次实验中梳孔连负极。6、 当溴酚蓝到达一定

22、位置时，停止电泳，进行EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。五、 实验结果1、涂布平板结果 图2 含氨苄青霉素的LB平板 图3 不含氨苄青霉素的LB平板2、图4 DNA纯度检测 20131015超螺旋Marker11，84910，0858，0236，1335，0263，9973，0492，087超螺旋 pUC19 pUC19/ 1 2 3 4 5 6 超螺旋 7 8 10 9 11 12 Marker HindII Marker 第二组为本组实验结果六、 实验结果分析1、 对比涂布平板 特点含氨苄青霉素的LB培养基中不含氨苄青霉素的LB培养基中不含pUC19菌落含pUC19菌落不含pUC1

23、9菌落含pUC19菌落生长与否否是是是形态无未形成单菌落菌落不明显有单克隆出现大小无大小大数量无多少多培养基颜色红色红色黄色微红色菌落颜色无红色黄色红色2、 从样本条带的荧光程度来看，得到的DNA含量同第一组及第三组差不多，亮度较高。但是有不少杂质。可能是在每次回收时回收的量比较多，包含了杂质。另外就是在除RNA和蛋白质的步骤时，没有操作充分。3、 以pUC19 DNA Maker为标准，迁移距离大体相同，提取的质粒大小符合预期效果。4、 通过与DNA Maker与其他实验组的点样孔比较发现，本组实验的点样孔DNA有滞留现象（点样孔内有荧光），说明有蛋白质的残留。解决方法：采用酚、氯仿、异戊醇

24、多抽提几次。5、 在最上端，出现三条明亮的条带，为残留的染色体DNA的片段。由于酶将他们切成大小不同的片段，所以呈现不止一个条带。原因可能是加入溶液I、II、III后没有充分混匀并使染色体DNA充分沉淀，另外在提取回收时所回收的量可能比较大，将部分杂质也一起回收。解决措施：可再离心处理，只取上清进行下步实验。6、 接着往下，出现两条较暗的条带，为被酶切后改变结构特征的质粒DNA，可能为线状和开环的DNA。7、 再往下最亮的一条带为所提取的螺旋型质粒DNA，约为2.69kb。带的亮度与DNA的量有关，与pUC19 DNA Maker相比约为其3倍，即300ng。所以所提取的质粒DNA浓度约为30

25、0ng/2L，即150ng/L.8、 最下端亮的部分为残留的RNA，由于分子量小，所以迁移速度最快。原因可能是RNase A没有将其降解完全或在加入饱和酚后取上清液时吸入了溶解在酚里的RNA。解决方法：可以再重新用RNase A降解再用饱和酚溶解一次。七、 实验注意事项1、为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。在整个质粒取过程中除去染色体DNA的关键步骤是加入溶液、溶液的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。加入溶液工时，可剧烈振荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液时，菌液变黏稠、透明，无菌块残留；加入溶液时，会立即出现

26、白色沉淀。加入溶液和溶液后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则，染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。 2、质粒DNA中蛋白质的去除通常采用酚、氯仿抽提。采用酚氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，但需要抽提多次。切记，质粒DNA溶解在上层的水相中。 3、酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。另外我们所使用的饱和苯酚溶液位于下层，吸取时应注意。 4、沉淀DNA通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA沉淀完全。除用乙醇沉淀DNA外，还可使用06倍体积的异丙醇，但异丙醇也能将盐等杂质沉淀，所以沉淀需要在常温下进行，并且时间不宜太长(限20 min内)。沉淀离心后，需用70乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。 5、电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳效果。如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液，并且，配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液应与电泳时使用的缓