人巨细胞病毒体外感染诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡

1、人巨细胞病毒体外感染诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡            人巨细胞病毒体外感染诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡    2008-5-9 11:56:31                       &

2、#160;                             【摘要】  本研究探讨人巨细胞病毒(hCMV)体外感染是否可引起早幼粒细胞的增殖、分化抑制、诱导其凋亡，并探讨其作用机制。 采用hCMV AD169 株体外感染早幼粒细胞白血病细胞HL60，用PCR 检测hCMV DNA，用形态学观察、DNA

3、 片段化检测及Annexin /PI 染色流式细胞仪检测等方法分析细胞凋亡情况。结果表明： hCMV AD169 株在体外能明显抑制早幼粒细胞白血病细胞HL60的生长，抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系；PCR 检测发现病毒感染组HL60 细胞中有hCMV IEA 的表达；形态学观察和DNA 片段化检测证实了细胞凋亡的存在；流式细胞仪检测结果显示HL60 细胞凋亡率随培养液中病毒浓度的加大和感染时间的延长而增高，二者呈依赖关系。结论： hCMV AD169株在体外可直接感染HL60 细胞；hCMV AD169 株在体外感染HL60 细胞后，可抑制HL60 细胞的分化和增殖；hCMV AD16

4、9 株体外感染HL60 细胞后可诱导其凋亡，且凋亡率与病毒剂量及作用时间呈依赖性关系。     【关键词】  人巨细胞病毒 早幼粒细胞白血病细胞 细胞凋亡 病毒感染         Human Cytomegalovirus Induces Apoptosis of Human Promyelocytic Leukemic Cells via Direct Infection In Vitro      &

5、#160;     Abstract    The study was purposed to investigate the proliferation  and the suppression effect of human cytomegalovirus (hCMV) on human promyelocyte cell line HL60, and to study whether hCMV can induce apoptosis of HL60  via direct infection in

6、 vitro  and its mechanism. Promyelocyte cell line HL60 and hCMV AD169 strain were cocultured. PCR was used to detect the direct infection of HL60 cells by hCMV IEA expression. The apoptosis cells were analyzed by morphologic observation, DNA ladder formation,  flow cytometry  with Ann

7、exin /PI stain. The results indicated that hCMV AD169 suppressed the differentiation and proliferation of HL60 cells in vitro significantly (P<0.05). The suppression was dosedependent. hCMV DNA was successfully detected in HL60 cells of viral infection groups by PCR. The apoptotic cells were conf

8、irmed by morphologic observation and DNA ladder formation. The results of flow cytometry showed that the percentage of apoptotic cells increased along with the increase of hCMV titer and the time after infection.  It is concluded that the  promyelocyte can be infected directly by hCMV AD16

9、9 strain. hCMV AD169 strain inhibited the differentiation and proliferation of promyelocyte.  The apoptosis of HL60 cells can be induced  by hCMV infection. With the increase of viral infectious titer and the time after infection，the percentage of apoptotic cells also increase and produce

10、in dosedependent and time dependent manner. Induced apoptosis may be one of the mechanisms of granulocytopenia  induced by hCMV infection.        Key words     human cytomegalovirus; promyelocytic leukemic cell; apoptosis; virus infection&#

11、160;           人巨细胞病毒（hCMV）是一种在人群中广泛存在的病毒，儿童是其原发感染的最主要的人群，受感染者的造血、血液系统是主要受累部位之一。对hCMV感染的研究，特别是对于器官移植后hCMV感染的研究，一直是国际上医学界关注的热点。如今，hCMV感染已被认为是骨髓移植和白血病化疗失败的主要原因之一。国内外学者对hCMV和造血细胞作用的研究多集中于CFUGM、CFUE、CFUMix及CFUMK方面，实验证实hCMV对各系造血祖细胞的分化和增殖均有抑制作用2，3。hCMV是否能诱

12、导早幼粒细胞白血病细胞凋亡的问题尚无定论，国内尚未有类似研究报道。本实验采 用hCMV体外感染早幼粒细胞白血病细胞系HL60，研究hCMV对早幼粒细胞白血病细胞的影响，并初步探讨其作用机制。        病毒        hCMV AD169株取自        人巨细胞病毒体外感染诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡    2008-5-9

13、 11:56:31                                                 资料

14、用均数±标准差（±SD）记录，各组间采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。对照组与各实验组进行比较，各实验组在不同的时间段进行比较。        结    果        PCR扩增各实验组中hCMV DNA        收集各实验组细胞，抽提DNA并进行PCR扩增，在2%的琼脂糖凝胶中电泳后，紫外灯下观察， 各实验组均可见一

15、条特异性扩增条带，约599 bp，而对照组未见阳性条带，提示病毒直接感染细胞，细胞中存在hCMV DNA（图1）。        Figure 1.  Expression of hCMV IEA in HL60 cells infected with hCMV.   M： marker.  Lane 1，2，3： 10-1，10-2，10-3  groups.    C：control group.    

16、;    各实验组不同时间的细胞存活率        在感染后3、5、7天，收集各组的部分细胞，进行台盼蓝染色，监测细胞存活力。结果显示：随着病毒浓度的加大，感染后时间的延长，各实验组的细胞存活率下降，对照组不受影响（图2）。        Figure 2. Effect of hCMV AD 169 on the survival rate  of HL60 cells at different days.

17、60;       Giemsa染色细胞形态学观察        hCMV感染细胞后，经Giemsa染色至感染后第5天，光学显微镜下观察显示，实验组中有些细胞透亮度减低，细胞膜皱缩、核碎裂，提示有凋亡改变。各实验组凋亡细胞数量略有不同，对照组未见明显凋亡细胞（图3） 。        Figure 3. Effect of hCMV AD 169 on the morphology of HL60

18、 cells with Giemsa stainning.  A,B:  morphology of infected cells. C:  morphology of control cells.    DNA断裂检测        分别于感染后3、5、7天收集各实验组细胞，粗提DNA，琼脂糖凝胶电泳观察，在感染后第5天、7天，可见典型的DNA梯形条带，随着感染剂量的加大， 条带逐渐明显（图4）。     

19、0;  Figure 4. DNA fragmentations in hCMVinfected HL60 cells.  M: marker. C: control group. Lane 1 ,2 ,3: 10-1，10-2，10-3 groups.        Annexin V/PI双染流式细胞仪检测        分别于感染后3，5，7天收集各实验组细胞，经处理后进行凋亡检测，记录凋亡率。结果发现，各实验组的凋亡率明显高于对

20、照组，且随着剂量的加大、时间的延长，凋亡率逐渐增加（表1）。        Table 1. Apoptosis rate of  HL60 cells  infected with hCMV   (Anxiexin V/ PI)  (n10,  ±SD)            PI染色流式细胞仪分析    

21、    分别于感染后3、5、7天收集各实验组细胞，经处理后进行凋亡检测，可见位于G1期前的亚二倍体峰，即为凋亡细胞群，记录凋亡率。观察发现，各实验组的凋亡率明显高于对照组，且随着剂量的加大，时间的延长，凋亡率逐渐增加（表2）。         讨    论        许多实验已证实，hCMV感染对造血祖细胞各系的分化、增殖均有抑制作用，并可诱导其凋亡2，3。hCMV感染细胞过程中首先

22、附着于细胞表面，在合适的离子和PH条件下，借其包膜蛋白（gB和gH）与细胞表面受体（低结合力的肝素受体和高结合力的蛋白受体）结合后，通过受体介导的机制进入细胞内。也可通过其他途径如直接穿过胞浆膜进入细胞内。病毒进入细胞内，病毒DNA被转运至细胞核内，在细胞内增殖，复制其核酸和蛋白质，产生子代，同时造成组织病变5。通过检测宿主细胞内的病毒核酸和转录产物可反映病毒对宿主细胞的直接感染，目前实验中通常使用PCR检测细胞的hCMV DNA 和用RTPCR检测hCMV自我复制的即刻早期（immediateearly， IE）mRNA的两种方法，以判断病毒是否侵入宿主细胞。本实验采取具有速度快，特异性强，

23、灵敏度高的PCR检测感染后HL60细胞内的hCMV DNA。实验过程中，按照步骤用hCMVDNA试剂盒抽提感染组和对照组细胞的核酸提取物，PCR技术特异性扩增后，经电泳显示特异性条带，各感染组特异性条带均阳性，DNA片段长度约599bp，与理论上设计的引物6 (P1: 5' ATGGAGTCCTCTGCCAAGAGA 3'  P2: 5' CAGCATGTGCTCCTTGAT 3')应扩增的产物基本一致，对照组中未见特异性条带，表明hCMV AD169株可直接感染HL60细胞。      &#

24、160; 我们的实验结果显示:病毒感染组HL60细胞的集落形成均出现不同程度的减少，表明hCMV AD169株实验株对HL60细胞的分化、增殖具有抑制作用。hCMV体外感染的HL60细胞受到了病毒损伤，其抑制程度与病毒感染浓度及时间有关，随着感染时间延长，病毒浓度加大，细胞受损程度在增大，呈剂量依赖性，抑制程度与病毒感染浓度呈正相关。国外有研究小组曾观察到hCMV感染对HL60细胞的凋亡无明显诱导作用。Moon等7报告hCMV Towne株体外感染HL60细胞，病毒对HL60细胞的凋亡影响不明显。本实验结果表明hCMV AD169株可明显引起HL60细胞发生凋亡。这可能与所用的病毒株类以及病毒

25、浓度不同有关。曾有研究者发现hCMV毒株的不同导致感染后造血祖细胞hCMV DNA的表达不同8。        hCMV感染所引起的损伤中，宿主细胞凋亡较为常见9。有研究表明，hCMV感染诱导的造血祖细胞生长抑制与细胞凋亡有关系。Sindre等10用hCMV感染造血祖细胞，发现细胞表面磷脂酰丝氨酸的表达减少，特异性的DNA凋亡片段数目增加，表明hCMV感染同样可以诱导造血祖细胞凋亡。本实验用目前比较成熟的定性法和定量法从这三个方面对hCMV体外感染HL60细胞株诱导凋亡进行定性定量的检测。结果表明：hCMV AD169株体外

26、感染能诱导HL60细胞凋亡，并随时间延长、病毒浓度的加大而上升。本实验中hCMV AD169株体外感染诱导HL60细胞凋亡，但其凋亡由哪种凋亡蛋白所介导，其作用位点在哪里，这些蛋白在其中起什么作用，以及如何阻断其凋亡，尚需今后的研究工作进一步深入探讨。         【参考文献】  1邵济钧. 巨细胞病毒. 见：闻玉梅主编. 现代医学微生物学.上海：上海医科大学出版社. 1999：925-9372Reusser P, Einsele H, Lee J, et al. Randomized mu

27、lticenter trial of foscarnet versus ganciclovir for preemptive therapy of cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Blood, 2002; 99:1159-11643何政贤，潘思年，陈健良等. 人巨细胞病毒对造血系统的影响. 中华儿科杂志, 2003, 41： 321-3244Demmler GJ. Cytomegalovirus. In: Feigin RD, Cherry JD. Textbook of Pediatr

28、ic Infectious Diseases. 4th ed. Philadelphia： W. B. Saunders Co. 1998: 1732-17465 怀特D.O, 芬纳F.J著（郑志明等译）. 医用病毒学. 北京, 科学出版社, 1990: 71-976熊伟, 何政贤, 王清文等. 巨细胞病毒对人骨髓粒巨噬系祖细胞生长的影响. 中华血液学杂志,1999; 20: 143-1457Moon MS, Lee GC, Kim JH, et al. Human cytomegalovirus induces apoptosis in promonocyte THP1 cells but

29、not in promyeloid HL60 cells. Virus Res, 2003; 94:67-778Minton EJ, Tysoe C, Sinclair JH, et al. Human    3                                       人巨细胞病毒体外感