不同品质粗饲料日粮对瘤胃发酵及主要纤维分解菌的影响

1、不同品质粗饲料日粮对瘤胃发酵及主要纤维分解菌的影响刘大程1,2，卢德勋2，侯先志1，高 民2，孙海洲2（1内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特 010018；2内蒙古畜牧科学院，呼和浩特 010030）摘要：【目的】研究不同品质粗饲料组成的混合日粮对绵羊瘤胃发酵功能和3种主要纤维分解菌的影响。【方法】以粗饲料分级指数GI为指标对粗饲料品质进行调配，在精粗比为28条件下配制3种混合日粮，其中含高GI粗饲料日粮组（H组，GI值2.89）、含中GI粗饲料日粮组（M组，GI值1.73）和含低GI粗饲料日粮组（L组，GI值0.65）。利用16S rRNA特异性寡核苷酸探针杂交法测定3种纤维分解菌的

2、数量变化。【结果】三组试验动物瘤胃液pH维持在正常范围，各组间差异不显著（P0.05），但H组pH变化更为平缓。随着GI指数的升高，瘤胃液NH3-N浓度呈升高势态，H组显著高于L组（P0.05），乙酸浓度有降低的趋势，而丙酸浓度则有上升的趋势，乙酸/丙酸出现降低趋势，各试验组TVFA浓度的平均值差异不显著（P0.05）。黄化瘤胃球菌在绵羊瘤胃中相对含量的总平均值为1.18%，白色瘤胃球菌的相对含量为2.44%，琥珀酸拟杆菌的含量为10.07%。【结论】不同品质粗饲料日粮显著影响绵羊瘤胃产琥珀酸丝状杆菌的数量，随着粗饲料品质的升高，该菌的数量有增加的趋势；不同品质粗饲料日粮改变了瘤胃的发酵方式和

3、发酵功能。关键词：粗饲料品质；瘤胃发酵；寡核苷酸探针；纤维分解菌；瘤胃细菌Effect of Dietary Forage of Different Qualities on Rumen Fermentation and Predominant Fibrolytic Bacterial PopulationsLIU Da-cheng1,2, LU De-xun2, HOU Xian-zhi1, GAO Min2, SUN Hai-zhou2(1Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018; 2Inner Mongolia Acade

4、my of Animal Sciences, Huhhot 010030)Abstract:【Objective】The effects of dietary forage of different qualities on rumen fermentation and populations of three species of ruminal celluloytic bacteria were studied.【Method】 Nine wethers with ruminal cannula were randomly divided into three groups, i.e. h

5、igh forage quality group (H group), middle one (M group) and low one (L group), according to Grading Index (GI) of forage. The sheep were fed three diets with same ratio of forage to concentrate (R/C) of 8:2 and included high quality forage (GI =2.89MJ), middle quality forage (GI =1.73 MJ) and lower

6、 quality forage (GI =0.65 MJ) , respectively. The relative populations of three species of celluloytic bacteria were determined by hybridization analysis.【Result】 The results showed that the ruminal pH values of the animals in the three groups were all in normal range, the differences among the thre

7、e groups were not significant (P0.05), and the change of pH values in the rumen of animals in H group was more mild. The ruminal NH3-N concentration had increasing tendency, the animals in H group showed significant higher increase than animals in L group (P0.05). The ruminal concentration of acetic

8、 acid in all groups had reducing tendency. The concentration of propanoic acid had increasing tendency and the ratio of acetate to propionate had reducing tendency. The differences of the ruminal concentration of total VFA concentration among the three groups were not significant (P0.05). The relati

9、ve amount of R. flaveciens, R. albus and B. succinogenes in the rumen were 1.18%, 2.44% and 10.07%, respectively. 【Conclusion】The populations of B.succinogenes in the rumen were affected significantly by different dietary forage qualities, the quantity of the bacteria had an ascendant tendency and t

10、he mode of rumen fermentation was changed with improving the quality of forage.Key words: Quality of forage; Rumen fermentation; Oligonucleotide probe; Cellulolytic bacteria; Ruminal bacteria0 引言【研究意义】粗饲料在反刍动物饲养中占有极其重要的地位。反刍动物瘤胃可以降解和消化纤维物质，瘤胃的这种强效降解作用是依靠瘤胃微生物来完成的，其中纤维分解菌发挥着重要的作用。了解纤维品质与纤维分解菌以及瘤胃发酵功能

11、之间的关系,可进一步阐明不同品质粗饲料对瘤胃发酵功能的影响。【前人研究进展】对粗饲料品质评定国际上已提出了多个指数，如饲料的相对值（relative feed value，RFV）、质量指数（quality index，QI）、粗饲料相对质量（relative forage quality，RFQ）以及产奶二千（Milk2000）等。每一种指数都有其优点，但在实际应用时也存在不足。卢德勋1在广泛吸取其它粗饲料评定指数优点的基础上，提出了评定粗饲料品质的GI指数，即粗饲料分级指数（grading index，GI）。目前GI指数的地方标准已制定并逐步在生产实际中推广应用。近年来以核糖体RNA为主

12、的分子生物学技术发展迅速，加快了瘤胃微生物区系的研究。随着微生物界16S rRNA序列数据库的完善和全新菌株特异性探针序列的出现，探针杂交分析法逐渐成为检测瘤胃细菌的有力手段24。【本研究切入点】瘤胃微生物种群数量和区系组成受诸多因素的影响，其中日粮是最重要的因素57。目前对瘤胃发酵功能和瘤胃微生物区系的研究，多是在日粮不同精粗比的条件下进行的8,9，即使在同一精粗比条件下，粗饲料不同品质也是影响瘤胃发酵功能的重要因素。【拟解决的关键问题】本研究旨在利用16S rRNA寡核苷酸探针杂交技术，研究不同品质粗饲料日粮条件下瘤胃3种纤维分解菌的数量变化，为进一步阐述瘤胃微生物对纤维物质的降解机制奠定

13、基础。1 材料与方法1.1 实验动物选择9只装有永久性瘤胃瘘管的蒙古绵羊，1.5岁，体重3540 kg，随机分为3组，每组3个重复，每日6：00和18：00饲喂2次，先粗后精，自由饮 水。1.2 实验日粮以GI指数为指标对粗饲料品质进行调配，然后在固定精粗比为28条件下配制3种混合日粮，高GI粗饲料日粮（H组）、中GI粗饲料日粮（M组）和低GI粗饲料日粮（L组），日粮组成和配方见表1。GI值为预测值，计算公式参考文献1。GI=ME（Mcalkg-1）DMI（kgd-1）CP（%DM）/NDF（或ADL）（%DM）ME：粗饲料代谢能；DMI：粗饲料干物质随意采食量；CP：粗蛋白，占干物质百分比；

14、NDF：中性洗涤纤维，占干物质百分比；ADL：酸性洗涤木质素，占干物质百分比。表1 日粮组成和营养水平（%）Table 1 Composition and nutrient levels of sheep diets (DM basis) in vivo项目Item高组High GI group中组 Middle GI group低组 Low GI group羊草 Chinese wildrye28.1857.2738.18玉米秸 Corn straw13.184.5537.27苜蓿 Alfalfa hay38.6419.094.55玉米 Corn16.3613.648.18麸皮 Wheat

15、bran1.181.820.91豆粕 Soybean meal0.913.279.55尿素 Urea0.090.180.18食盐 Salt0.310.310.31复合添加剂 Mixed additives0.600.600.60石粉 Limestone0.550.180.27合计 Total100.00100.00100.00代谢能 ME (MJkg-1)8.498.337.84粗蛋白 CP(%)10.8710.5110.01Ca (%)0.310.250.24P (%)0.180.170.17ADF (%)30.5333.3735.98NDF (%)49.7856.4660.93RDP(g)

16、85.2283.3880.03NSC(%)26.6122.9918.30NDF：NSC1.872.453.32混合粗饲料GI值(MJ)GI value of mix forage2.891.730.65复合添加剂成分(每kg)：硫酸亚铁；硫酸铜；硫酸锰；硫酸锌；氯化钴；碘化钾；亚硒酸钠；VA 1, 620, 000IU；VD3 324, 000IU；VE 540IU；VK3 150 mg；VB1 60 mg；VB2 450 mg；VB12 0.9 mg；VB5 1, 050 mg；泛酸钙；叶酸Per kilogram mixed additives provides: FeSO47H2O 17

17、0 g; CuSO45H2O 70 g; MnSO45H2O 290 g; ZnSO47H2O 240 g; CoCl26H2O 510 mg; KI 220 mg; Na2SeO3 130 mg; VA 1, 620, 000IU; VD3 324, 000IU; VE 540IU; VK3 150 mg; VB1 60 mg; VB2 450 mg; VB12 0.9 mg; VB5 1, 050 mg; Pantothenic acid 750 mg; Folic acid 15 mg1.3 样品的采集及处理用采样管从瘤胃瘘管伸入瘤胃中下层，混合之后取瘤胃内容物40 ml，放入带封口的塑

18、料袋中，加入等体积磷酸缓冲液（pH 6.0，0.2 molL-1），冰浴双手适度揉搓5 min，使内容物与缓冲液充分混合，双层纱布过滤，滤液在4下1 000g离心15 min，上 清液在4下10 000g离心25 min，细胞沉淀加适量磷酸缓冲液悬浮，置于-80用于斑点杂交实验分 析10,11。1.4 指标测定 挥发性脂肪酸（VFA）测定 内标法测定（日本岛津GC-7A气象色谱仪），内标物为巴豆酸。取瘤胃液10 ml在4 000 r/min离心15 min，取上清液4 ml加入25%偏磷酸溶液1 ml，静置40 min后，取1 ml混合液加入2 g酸性吸附剂（Na2SO4：50%H2SO4：硅

19、藻土（WV）=30120）和40 ml巴豆酸溶液（31.25 mmolL-1，溶剂为CH3Cl3），摇匀，澄清后上机测定。 pH值及氨态氮（NH3-N）测定 瘤胃液pH值、氧化还原电位（ORP）采用PHS-3B型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）直接测定，NH3-N测定参照冯宗慈 等12方法进行。 纤维分解菌数量测定 选用寡核苷酸探针杂交定量分析法2,13，测定产琥珀酸丝状杆菌、黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌在瘤胃细菌总数所占比例的相对含量。16S rRNA序列数据来自于核糖体核酸数据库（RDP），选择4种具有种特异性的寡核苷酸序列为探针见表2。 数据统计分析 基本处理采用Excel软件，结果分析采用S

20、PSS 12.0统计软件进行方差分析，均值的多重比较采用Duncan法进行。表2 寡核苷酸探针序列Table 2 Oligonucleotide probes used in hybridization analysis序列编号 Probe name核苷酸序列(5-3) Probe sequences目标菌株 Target洗涤温度 Temperature ()S-D-Bact-0338-a-a-18S-S-F.suc-0650-a-A-20S-S-R.fla-1296-a-A-20S-S-R.alb-0196-a-A-18GCTGCCTCCCGTAGGAGTTGCCCCTGAACTATCCAA

21、GATTCTCTTTGTTAATTGCCATGTCATGCGGCTTCGTTAT细菌探针 Bacteria probe琥珀酸丝杆菌B. succinogenes黄化瘤胃球菌 R. flaveciens白色瘤胃球菌 R. albus544846462 结果与分析2.1 不同粗饲料品质对瘤胃内环境和瘤胃发酵的影响 瘤胃液pH 各组绵羊瘤胃液pH在6.316.89之间，处于正常生理范围内（pH 5.57.5）14，且各组间差异不显著（P0.05）。在一个饲喂周期内3个试验组瘤胃pH动态变化规律基本相似，晨饲后pH开始下降，在饲后46 h达到最低水 平，之后逐渐升高，12 h升高到与0 h接近（表3和

22、图1）。 瘤胃液氧化还原电位（ORP） 瘤胃液ORP值的变化趋势是H组M组L组，3组之间无显著差异（P0.05），各试验组瘤胃液ORP值的动态变化基本相同，采食后ORP值开始下降，L组4 h后开始回升，H组和M组6 h后逐渐回升，612 h间3组ORP值均呈上升趋势（图2）。 瘤胃液NH3-N浓度 各组绵羊瘤胃液氨氮浓度变化见表3。H组NH3-N浓度显著高于L组（P0.05），二者与M组均无显著差异（P0.05）。各组瘤胃NH3-N浓度均在采食后2 h达到最高，以后缓慢下降，在饲后2 h，H组NH3-N浓度极显著高于M组和L组（P0.01），见图3。 瘤胃总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度与乙酸/

23、丙酸比例 M组总VFA 浓度略高于H组和L组，三者之间差异均不显著。H组总VFA浓度经2 h快速达到最高值，之后逐渐下降，而M组和L组的最高值出现在饲后4 h。H组乙酸/丙酸比例显著低于M组和L组（P0.01），尤其是饲后4 h和8 h。2.2 不同粗饲料品质对瘤胃内3种主要纤维分解菌的影响 黄化瘤胃球菌的变化 H组菌数在饲后2 h内图1 不同粗饲料品质对绵羊瘤胃pH的影响Fig. 1 Effect of forage of different qualities on pH value in the rumen表3 不同品质粗饲料日粮对瘤胃发酵的影响Table 3 Effect of for

24、age of different qualities on the rumen fermentation项目 ItemH组 High groupM组 Middle groupL组 Low group瘤胃液pH6.630.196.480.156.480.14氧化还原电位 ORPmv-1-214.0033-204.0034-196.0029氨态氮 NH3-N (mgdl-1)8.750.58a7.670.65ab6.440.59bBCP浓度 (mg100ml-1)27.143.9626.745.9424.496.41乙酸 Acetate (mmolL-1)28.476.05a32.294.11b3

25、1.965.19b丙酸Propionate (mmolL-1)14.713.0014.132.1013.952.27丁酸Butyrate (mmolL-1)9.661.71a9.541.09a8.541.28b总挥发酸Total VFA (mmolL-1)52.849.1255.966.2854.457.42乙酸:丙酸 Acetate to propionate ratio 1.970.35A2.300.25B2.320.37B同一行数字不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）Values with different small letter supe

26、rscripts in the same row means significant difference（P0.05）,while different capital superscripts means significant difference（P0.01）图2 不同粗饲料品质对瘤胃氧化还原电位的影响Fig. 2 Effect of forage of different qualities on ORP in the rumen 图3 不同粗饲料品质对绵羊瘤胃液NH3-N浓度的影响Fig. 3 Effect of forage of different qualities on NH

27、3-N concentration in the rumen呈下降趋势，然后开始上升，4 h时达到最高为1.63%，M组菌数饲后一直呈上升状态，4 h时达到最高为1.91%。H、M组在4 h以后逐渐降低，12 h时达到最低。L组的变化无规律性，在一个饲喂周期内菌数曲线呈波浪状，饲后8 h菌数达到最高值，含量为2.97%。在3种不同品质粗饲料日粮之间，黄化瘤胃球菌的含量表现为L组H组M组，三者之间无显著差异（表4和图6）。 白色瘤胃球菌的变化 白色瘤胃球菌相对含量的结果为M组H组L组，H组和L组的菌数在饲喂后逐渐增加，H组2 h达到最高为3.4%，L组8h图4 3种不同粗饲料品质对绵羊瘤胃TVF

28、A的影响 Fig. 4 Effect of forage of different qualities on TVFA concentration in the rumen 图5 3种不同粗饲料品质对绵羊瘤胃乙酸/丙酸比例的影响Fig. 5 Effect of forage of different qualities on rumen acetate to propionate ratio图6 不同品质粗饲料日粮对黄化瘤胃球菌相对数量的影响Fig. 6 Effect of forage of different qualities on the relative populations of

29、 R. flaveciens 达到最高为3.72%，两组分别达到最高值后均呈下降趋势。M组菌数出现先下降后升高再下降的趋势，最高值出现在饲后8 h，含量为4.04%（表4和图7）。图7 不同品质粗饲料日粮对白色瘤胃球相对数量的影响 Fig. 7 Effect of forage of different qualities on the relative populations of R. albus 产琥珀酸丝状杆菌的变化 产琥珀酸丝状杆菌相对含量表现为L组M组H组，H组和L组菌数在饲喂后逐渐增加，4 h时均达到最高值，分别为12.63%和10.49%，以后逐渐下降。M组表现先下降后升高再下

30、降的势态，其最高值出现在饲后8 h，含量为11.84%（表4和图8）。图8 不同品质粗饲料日粮对产琥珀酸丝状杆菌相对数量的影响Fig. 8 Effect of forage of different qualities on the relative populations of B. succinogenes3 讨论 3.1 粗饲料分级指数（GI）与日粮配方反刍动物瘤胃是一个相对稳定的厌氧生态发酵罐，健康的瘤胃发酵功能和稳定的内环境决定着日粮的消化和动物的生产性能。以往对瘤胃发酵功能的研究多数是在不同精粗比条件下进行的，随着研究的深入人们发现精粗比这一概念比较笼统，不能准确描述粗饲料的营养特

31、性。本试验选用的粗饲料分级指数（GI）是卢德勋 1在继承粗饲料相对值（RFV）内涵的基础上提出的一个较新的粗饲料品质综合评定指数，GI指数综合考虑了粗饲料的可利用能、粗蛋白、饲料中难以消化的组分如NDF以及动物的采食量。同RFV值相比，GI值考虑了粗饲料的代谢能和粗蛋白，能够更真实的反应粗饲料在生产中的实际营养价值，GI值的理论和科学性经过了试验验证15,16。本试验先以GI指数为指标调配3种不同品质的粗饲料，然后再配制3种混合日粮。通过调配精料补充料使3个试验组的ME和CP保持在相对一致的水平，并且3组间的RDP也相差不大，这样减少了由于蛋白来源含量不同对试验造成的影响。通过这种试验设计，比

32、较研表4 不同粗饲料品质对3种纤维分解菌数量的影响（%）Table 4 Effect of forage of different qualities on the relative populations of celluloiytic bacterial species (as percentage of the total bacterial population) 项目 ItemH组High groupM组Middle groupL组Low group纤维分解菌平均值Average黄化瘤胃球菌 R. flaveciens1.140.371.040.621.360.931.180.16白

33、色瘤胃球菌 R. albus2.380.702.640.972.300.872.440.18产琥珀酸丝状杆菌 B. succinogenes11.151.30a10.131.39ab8.921.31b10.071.123种纤维分解菌总数占细菌总数的比例14.661.9513.802.5012.592.2613.681.04Sum of the relative populations of celluloiytic species (%)同一行数字上标不同小写字母表示差异显著（P0.05）Values with different small letter superscriptsin the

34、 same row means significant difference (P0.05)究在相同精粗比条件下高品质粗饲料加一般精料与低质粗饲料加优质精料对瘤胃发酵功能的影响。结果表明前者更有利于瘤胃功能的健康，成本也较低，可指导生产。3.2 不同品质粗饲料日粮对瘤胃发酵的影响采食3种不同品质粗饲料日粮，受试羊的瘤胃pH维持在6.316.89之间，适合瘤胃微生物生长，其中H组pH变化更为平缓，这在一定程度上有利于瘤胃内微生物区系的平衡和内环境的稳定。采食2 h后ORP显著下降（P0.01），可能是由于瘤胃微生物大量繁殖，其代谢产物中含有大量的还原性物质，从而导致ORP降低。瘤胃BCP浓度、V

35、FA和NH3-N浓度是反映饲料在瘤胃内发酵状况的重要指标，在采食后2 h后3个试验组ORP值均显著下降（P0.01），可能是由于瘤胃微生物大量繁殖后，其代谢产物中含有多量的还原性物质，从而导致ORP降低。瘤胃BCP浓度、VFA和NH3-N浓度是反映饲料在瘤胃内发酵状况的重要指标，采食2 h后3个试验组瘤胃液NH3-N浓度均明显上升，以后逐渐下降。随着粗饲料品质的升高，乙酸浓度有降低的趋势，而丙酸浓度则有上升的趋势，乙酸/丙酸出现降低趋势。丙酸是反刍动物体内主要的生糖物质，促进丙酸生成有利于提高动物的生产性能。3.3 纤维品质与纤维分解菌之间的关系粗饲料纤维包括纤维素数量和纤维素品质两个方面。有

36、关纤维数量对纤维分解菌的影响已有大量研究报道，当瘤胃中的纤维素含量增加时纤维分解菌的数量也相应增加，而在低纤维和高淀粉日粮时纤维分解菌数量较少或缺乏17,18。不同种类的粗饲料其纤维品质具有很大的差异。有关纤维品质与纤维分解菌关系的研究报道较少。本试验结果表明，随着粗饲料品质的升高，黄化瘤胃球菌的数量表现下降的趋势，产琥珀酸丝状杆菌则呈现升高的态势，而白色瘤胃球菌未表现出明显的规律性。由于产琥珀酸丝状杆菌的含量远远大于2种瘤胃球菌，因而瘤胃纤维分解菌总数的变化趋势与产琥珀酸丝状杆菌基本一致。高品质的粗饲料其纤维品质也很好，能够向瘤胃微生物提供更多的易消化的细胞壁物质、蛋白质和营养底物，有利于刺

37、激纤维分解菌的 生长和繁殖，因而H组纤维分解菌总数均高于其它两组。3.4 日粮NDF/NSC不同比例对瘤胃发酵的影响美国康奈尔大学评价牛日粮的净碳水化合物和蛋白质体系（CNCPS）中，将瘤胃微生物分为两大类，发酵非结构性碳水化合物（NSC）微生物和发酵结构性碳水化合物（SC）微生物。只要有合适的氮源，两类微生物的生长速率和分解终产物直接与碳水化合物的消化成比例19，因而调整反刍动物日粮中纤维的组成和含量，可以调控瘤胃中碳水化合物的分解、pH和VFA产生以及调节氮源的利用，最终可影响微生物的合成和动物的生产性能。通常纤维多用NDF来表示，NDF包括纤维素、半纤维素和木质素。非结构性碳水化合物（N

38、SC）包括淀粉和可溶性糖。本试验采用NDF/NSC的比例来衡量日粮组成中纤维和非结构性碳水化合物所占比例。NSC要比NDF降解快得多，NSC的快速降解可能导致VFA的积累，使瘤胃pH值下降、渗透压升高。纤维降解对低pH值很敏感，在较低pH值条件下，纤维的降解速度会降低。若NDF在瘤胃中的积累可导致采食量下降，因此，NDF/NSC比例适宜才有利于瘤胃功能的健康20。本试验34 结论不同品质粗饲料日粮显著影响绵羊瘤胃产琥珀酸丝状杆菌的数量（P0.05），改变瘤胃的发酵方式，当日粮NDF/NSC为1.89有利于瘤胃功能的健康。高品质的粗饲料加一般精料的饲喂效果好于低质粗饲料加优质精料。Referen

39、ces1卢德勋. 乳牛营养技术精要. 华西希望集团2001年动物营养学术研讨会论文集, 2001.Lu D X. Dairy cow nutrition technique. The Thesises of Animal Nutrition Academic Discussion, Hua Xi wish group, 2001. (in Chinese)2Stahl D A, Flesher B, Mansfield H R, Montgomery L. Use of phylogenetically based hybridization probes for studies of rum

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