基因工程植酸酶表达的优化途径和方法

1、第27卷增刊2006年9月同济大学学报(医学版)JOURNALOFTONGJIUNIVERSITY(MEDICALSCIENCE)Vol.27Suppl. Sep.,2006文章编号:1008-0392(2006)S1-0079-05基因工程植酸酶表达的优化途径和方法龙 元综述,刘钟滨审校(同济大学医学院微生物教研室,上海 200331)关键词:植酸酶;优化;基因工程中图分类号:R37 文献标识码:A 植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸水解酶(Myo)inositolhexaphosphatephosphohydrotase),是催化植酸及植酸盐分解成肌醇和无机磷酸盐的一类磷酸酶。该酶分为三

2、类:肌醇六磷酸232磷酸水解酶(32植酸酶EC3,1,3,8)、肌醇六磷酸262磷酸水解酶(62植酸酶EC3,1,3,26)和非特异的磷酸单酯酶(EC3,1,3,2)。在饲料中添加植酸酶能使饲料中的植物有机磷得到有效的利用,降低了粪便中有机磷的含量,减少了环境污染;并且减少植酸的抗营养作用,释放许多有益的金属离子,促进动物对蛋白质、氨基酸和碳水化合物的消化吸收。因此植酸酶的研究已成为酶制剂研究的一个热点。国内外研究人员已经通过基因工程的手段成功克隆植酸酶基因,然后在生物反应器中高效表达,以解决植酸酶在原始天然材料中含量低而难以大量提取的问题。但是植酸酶在表达过程中受基因内部结构、分泌信号、启动

3、子、发酵条件等诸多因素影响,使其表达常常偏低甚至不表达。因此,对各种可能影响植酸酶表达的因素进行系统分析,通过各种途径提高植酸酶表达并优化其性质具有十分重要的理论和实践意义。1 选择适当的表达系统微生物、植物、动物都可以作为植酸酶的表达系统。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统,是分子生物学产业化发展的重要工具。此系统具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、稳定性好以及适用范围广等优点。Nickolay等1纯化后的植酸酶活性为310U/mg,pH作用范围1.56.5,最适pH为4.9,最适反应温度4045e。但同时该表达系统也有明显的缺陷,如表达产物(蛋白

4、质)缺少翻译后修饰,高表达时易折叠错误导致表达产物没有活性,表达的蛋白多以包涵体形式存在,需要经过复杂的变性复性过程才能恢复构象和活性。而且大肠杆菌本身含有内毒素等有毒蛋白,可能混杂在终产物里,导致在医药方面的使用受到局限2。酵母是单细胞低等真核微生物,作为表达系统具有独特的优点。与大肠杆菌不同的是,酵母可以对异源蛋白进行修饰,当采用酵母信号肽时,蛋白能被正确折叠和加工,然后分泌到培养基中,能适应工业化生产的需要。此外,酵母易培养、繁殖快;遗传背景清楚,便于进行遗传操作,且使用安全,已长期广泛应用于酿酒和食品工业。用于表达外源蛋白质的甲醇营养型酵母的宿主菌主要是巴氏毕赤酵母(P.pastori

5、s,Pp)和多型汉逊酵母(H.polymorpha,Hp)两种。此类酵母生存能力强,易于培养,在廉价的非选择性或半合成培养基上能高密度生长,其主要特性是利用甲醇作为唯一碳源和能量来源。用该系统表达蛋白可以获得大于1g/L的目的蛋白,由此可把此类系统列入表达量较高的真核表达系统之一2。Seonho等3将来源于大肠杆菌的植酸酶AppA2在毕赤酵母中表达,重组植酸酶分子量56kD,摇瓶发酵最高酶活272U/ml,最适pH3.5,最适温度55e。虽然酵母具有上述优点但也有不尽人意之处,在酵母中表达的外源蛋白容易出现过度糖基化现象,这一现象可阻碍外源蛋白的运输和分泌。此外,外源蛋白还可能形成聚合体而影响

6、表达效率,其信号肽加工不完全或蛋白质的内部降解等,可造成表达产物的差异,产生极不均一的现象,为表从变形杆菌基因组中扩增出植酸酶phyA基因片段,在大肠杆菌中表达。收稿日期:2006-06-23作者简介:龙 元(1979-),女,硕士生.同济大学学报(医学版)第27卷达产物纯化和工业化生产带来困难。且大多酵母表达系统需要甲醇诱导,甲醇的浓度和诱导时间直接影响细胞的生长和外源蛋白的表达,而且甲醇是有毒性的化学物质,给产品的纯化带来一定困难。同其他表达系统相比,用曲霉菌表达外源蛋白质有很多益处:它具有强的分泌蛋白的能力,表达的外源性蛋白有较好的糖基化特性,分泌途径中存在分子伴侣能帮助蛋白正确折叠,因

7、此曲霉菌能分泌出具有真正活性的成熟蛋白。而且植酸酶基因中G+C含量高,是丝状真菌中高效表达蛋白质编码序列所具有的特征之一。Luis等4将分离到的烟曲霉的植酸酶基因在黑曲霉中表达并研究其酶学性质,显示其催化活性有更宽的pH范围和更高的热稳定性,且在37e也能保持较高活性。虽然曲霉菌表达的蛋白产量已经较高,但是距商业化生产仍有一定距离。主要原因是在转录水平上mRNA的不稳定性和翻译以及翻译后过程中蛋白质量控制、蛋白加工等方面的问题,还有蛋白酶的降解作用。在今后的工作中可以针对这些问题作出改善以提高外源蛋白表达产量。植酸酶作用的底物)植酸常存在于植物性饲料中,如玉米、大豆等种子,如果通过基因工程手段

8、使植物种子中含有足量的植酸酶,饲喂过程中它们在动物的胃肠道中释放出来降解的植酸,这样就可省去植酸酶添加剂的生产及在饲料中的添加,一举两得,这无疑是植酸酶应用的最佳方法。通过转基因植物生产植酸酶有以下优点:(1)植物能利用阳光、水分、肥料生产植酸酶,使生产成本达到最低;(2)植物细胞系统可以对表达产物进行糖基化、酰基化、磷酸化等准确的翻译后加工,使酶蛋白具有良好的生物活性;(3)在植物中表达的植酸酶不必进行酶的纯化,且能在种子中长期稳定保存,易于长距离运输和普及推广;(4)转基因植物可以通过杂交进行植酸酶基因积累,或传递给其他非转基因植物5。Coel2lo等将大肠杆菌的植酸酶基因连同一段液泡定位

9、表达信号肽序列在胚特异性启动子的控制下转化拟南芥,在转基因植株干种子中检测到了植酸酶的活性,且内部植酸的水平有所降低,无机磷酸盐的含量相对提高。研究表明,在胚中特异表达的植酸酶能够在胚发育过程中降低其中的植酸水平。尽管转基因植物生产植酸酶的优势很明显,但其自身仍然存在一些问题。首先,植物体内重组植酸酶表达量低,在种子中的最大含量仅占可溶性蛋白的15%左右。其次,重组植酸酶热稳定性、最适pH、最适温度及抗蛋6白酶的能力等有待进一步改善5。综上所述,由于每一类表达系统都有其自身的特点和适用范围,因此如何选择高效的表达系统就显得尤为重要。2 提高植酸酶表达量的方法2.1 密码子的优化在不改变氨基酸组

10、成的前提下,将编码外源蛋白的密码子优化为表达系统的偏爱密码子,可以实现外源蛋白表达量的显著提高。例如在酵母中表达量较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子。在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时,对植酸酶phyA基因活性位点保守序列R81HGX、R85XP的两个Arg密码子进行优化,选用毕赤酵母高频使用的Arg密码子AGA替换81位和85位低频使用的CGT和CGG密码子。在所编码氨基酸序列不变的情况下探讨密码子优化效果,结果表明密码子优化的酵母转化子中植酸酶酶活可达47600U/ml,比未进行密码子优化的重组酵母酶活提高了l倍,可见酵母优先利用偏爱密码子,在一定程度上提高了翻译速度,从而提高了酶产量

11、2.2 分泌信号的改造7。由于植酸酶是一种胞外酶,表达的蛋白要分泌到胞外必须经过信号序列的引导。信号肽与目标蛋白相融合,从而在蛋白质加工折叠后引导其分泌到胞外。信号肽没有严格的专一性,因而可利用宿主细胞本身信号序列或在表达载体的启动子后加人一个编码信号肽的序列,分泌外源蛋白。有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了,如人血清白蛋白、酵母转化酶等分泌蛋白,用其自身的信号肽序列即可在巴氏德毕赤酵母中成功表达。当不能利用蛋白本身的信号肽序列时,可利用表达载体的分泌信号,如来源于酿酒酵母的A性成熟因子信号肽和巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽,其中以A性成熟因子信号肽最为成功,也是使用最广泛的信号肽。信号肽

12、结构的改变可能会提高分泌效率。例如用经过修饰的人血清白蛋白天然信号肽可使人血清白蛋白在毕赤酵母中的分泌提高几倍;在A性成熟因子信号肽和目的基因之间插入一个间隔肽可以提高外源蛋白的表达水平。Martin等8将烟曲霉中的phyA基因置于glaA启动子之下表达。他们在原来的葡萄糖淀粉酶和外源蛋白之间插入一个Kex22蛋白酶切割位点,这样就能使内源性的Kex22蛋白酶对嵌合体蛋白进行有效的加工处理。在用深层发增刊龙 元 等:基因工程植酸酶表达的优化途径和方法酵(submergedfermentation,SmF)技术分批发酵时得到的最大酶活200U/ml。2.3 选择高表达的启动子为了提高外源蛋白的表

13、达,要使用强启动子。丝状真菌中常使用的强启动子有纤维素酶的cbhl、葡萄糖淀粉酶的glaA,32磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA等。木霉的eglt基因在ebhl启动子的调控下,其表达量比原来提高10倍。巴斯德毕赤酵母表达最常用的启动子为乙醇氧化酶AOX1,AOX2启动子是甲醇诱导型启动子。如果外源蛋白不能表达或表达量过低,可以选择其他强启动子进行表达。有时也需要构建一个嵌合型的启动子,包括强启动子的TATA、CAAT序列和来自不同启动子的抑制子和增强子。2.4 遗传突变关于通过遗传突变来提高植酸酶产量的报道相对来说比较少。Chelius和Wodzinski在通过紫外线突变改良黑曲霉NRRL3135菌

14、株的过程中,分离出了一种植酸酶高产株,比野生株的植酸酶产量高了3.3倍。然而他们方法的应用受到限制,因为在初步筛选时缺乏区分植酸酶和酸性磷酸酯酶的特异性和敏感性的方法。因此能找到一种将植酸酶活性从酸性水解作用中区分出来的方法,就能进一步提高筛选植酸酶高产株的效率。2.5 防止外源蛋白降解外源基因在表达的过程中同时伴随着一定量的蛋白酶的表达。因此,表达的外源蛋白就存在被降解的可能,在一定程度上影响蛋白质的表达量,同时,还给目的蛋白的纯化带来难度。为了提高外源蛋白在发酵液中的稳定性,免受蛋白酶降解,可采用以下几种方法:(1)使用蛋白酶缺陷株作为受体菌,保护外源蛋白不被降解。(2)培养基中添加蛋白胨

15、或酪蛋白水解物等物质作为蛋白酶的底物。(3)可调节溶液pH值抑制蛋白水解酶活性,防止目的蛋白降解。(4)突变外源蛋白基因的个别位点,改变其蛋白序列中蛋白酶的作用部位使其免受蛋白酶的破坏。2.6 发酵条件的优化要选择一种合适的生产技术,菌株类型,培养基成分,培养条件以及营养素的利用率都应列入考虑范围,因为它们都是影响产量的关键因素。固态发酵(solid2statefermentation,SSF)和深层发酵(SmF)的技术都已经用于植酸酶的生产。Stockmann等10研究了来自多形汉森酵母的植酸酶在深层发酵时缺氧条件下的产量,发现在葡萄糖培养基中预培养过的菌株在缺氧条件下产量提高了25%,而非

16、缺氧条件下据9观察菌株有一个20h的停滞期。Kleist等11研究在保持葡萄糖浓度并且低氧的条件下,大肠杆菌规模发酵条件下胞外植酸酶的产量。他们发现始终保持低氧水平(5%10%),细菌会出现快速的葡萄糖摄取,并且在很短的培养时间内(14h),就能出现较高的植酸酶活性(120U/ml)。培养基成分、接种的容量以及它的质量对酶产量均会产生影响。高磷酸盐浓度会抑制酸性磷酸酯酶和植酸酶的合成,而一定的磷酸盐浓度可以引起植酸酶的表达。Kim等发现曲霉菌5990的胞外植酸酶产量在磷酸盐浓度较低时(50mg/L)是最大的,而磷酸盐浓度较高时(100mg/L),酶产量大大降低。Al2Asheh和Duvnjak

17、将碳黑曲霉在canolameal(卡奴拉油菜籽饼粉,一种动物饲料)中(37%40%蛋白和4%6%植酸)进行固体发酵,研究表面活性剂如Tween280(吐温80),Triton2X2100(聚乙二醇辛基苯基醚),Na2oleate(油酸钠)对植酸酶产量和植酸含量减少有什么影响。在油酸钠(1%)和Tween280存在的情况下植酸酶产量增加,这可能是因为改变了细胞通透性,使酶释放得更多。同样的,Mand2viwala和Khire也发现在培养基中加入0.5%Triton2X2100,黑曲霉NCIM563产生的植酸酶活性增加了30%。培养基中碳源与氮源的比例即碳氮比(通常用C/N表示)直接影响菌体的生长

18、、繁殖和酶的生成。当C/N比值过低时,即培养基中氮源过多,造成微生物生长过盛,而碳源供应不足,容易引起菌体衰老和自溶,造成氮源浪费和酶产下降;如果C/N比值过高,即氮源不足,微生物生长过慢,一方面容易引起杂菌感染,另一方面由于没有足够量的微生物来产酶,也会造成碳源浪费和酶产量下降。因此,应根据各种微生物的特性,恰当的选择适宜的C/N比值是提高酶产量的重要措施。各种无机盐类和微量元素如磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙等是微生物细胞结构的重要成分或酶的组成成分,对于促进微生物的生长、发育,刺激酶的生成和维持酶的活性均具有重要作用。对于含复杂成分的培养基来说,原料和水中往往已含有足够量的无机元素,一般不需

19、另外添加。但不同菌种的需要量不同,应通过实验来研究确定。另外如果培养物的容量太小,或者培养基缺少了淀粉而相对的黏度较低,微生物会形成菌丝体小球降低植酸酶产量。培养基的pH和温度对酶的产量也有影响,培养基酸性pH值通常会使异源蛋白失活,或者是激1312同济大学学报(医学版)第27卷活那些能够降解异源性蛋白的蛋白酶。Juge等14发现在ACMN培养基中,黑曲霉菌的培养液pH值为3.0时,酸性蛋白酶被激活,引起重组燕麦A2淀粉酶被大量降解。生长温度会影响菌丝体的形态,从而影响外源性蛋白的产量。只有为培养物提供一个最适的环境,菌体的代谢活动才能得到最充分的表达,酶产量才高。3 植酸酶性质的优化3.1

20、提高植酸酶活性植酸酶作为一种生物酶制剂其固有弱点就是热稳定性差,容易失活,即使是在常温条件下长期存放的干燥酶粉也易失活。国内外研究人员对此进行了深入研究提出了一些提高热稳定性的方法:(1)自然选择法,筛选耐高温菌种释放的植酸酶。(2)蛋白质工程法,即通过基因工程重组得到耐高温的基因,再表达获得热稳定性的酶。随着基因工程技术和分子生物学技术的发展,这种方法已逐渐成为研究蛋白质热稳定性的主要手段。目前常用的有三种方法:¹推理设计。主要是把热稳定蛋白与热不稳定蛋白的氨基酸序列进行比较,分析究竟是哪些氨基酸对蛋白的热稳定性起关键作用。由于不知道究竟是哪些关键残基控制着温度敏感性的酶,所以在蛋

21、白质工程中研究中为获得热稳定性改善的工业用酶,仍缺乏/百发百中0的分子设计手段。目前普遍采用的手段是基因定向突变,通过改变某个或几个氨基酸来改变蛋白质结构,提高热稳定性。º定向进化。主要包括多轮随机突变和DNA改组技术。多轮随机突变是以目的基因进行第一轮随机突变,然后筛选出最佳突变子作为下一轮突变的亲本,如此循环下去获得性状优良的突变体。DNA改组是指DNA分子的体外重组,通过改变单个基因原有的核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物新功能。实际上是一种分子水平上的定向进化。»同序概念是一种半推理的方法。Lehmann等16-17综上所述,植酸酶在宿主体内表达受多种因素影响,

22、植酸酶基因在基因组中的整合位置,植酸酶的m1918就运用了同序概念的方法,以13个有一定同源性的已知植酸酶序列作为母本,借助计算机的帮助,从中选择对每一氨基酸位点最保守的残基拼成序列,然后增刊龙 元 等:基因工程植酸酶表达的优化途径和方法转录、翻译、加工以及分泌等过程都会影响其最终的产量,必须根据研究目的综合运用以上的策略才会获得最佳效果。同时提高酶的综合性能也很重要。人们在提高酶活性,增强它对蛋白酶的抗性、耐热性及抗酸性等方面已经做了很多工作,今后在这些方面一定会有更多的突破,使植酸酶有更广泛的应用。参考文献:1 ZininNV,SerkinaAV,GelfandMS,etal.Genecl

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