植物生理生化指标测定

1、植物生理生化指标测定小黑豆相关生理指标测定1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量， 每个测6个重复。株高：取处理好的植株， 测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度， 记录，每个测6个重复。主根长：取处理好的植株， 测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。叶面积：取处理好的植株， 选择第二节段的叶片， 测量叶面积， 叶面 积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA和H2O2含量测定 样品处理：取0.5g样品

2、（叶片要去除叶脉、 根要先用清水清洗干净），速 在液氮中冻存， 在遇冷的研钵中加液氮研磨， 然后加入1.5ml的 Tris-HCI （pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4C, 12019rpm离心15min ,取上清，保存在-20C下，上清液可用于总 蛋白、丙二醛（MD） 可溶性糖和H2O2含量测定。总蛋白测定（Bradford 法）：样品反应体系（800ul H20+200ul Bradford+5ul 样品）， 空白 对照为 （800ul H2O+200ul Bradford ）。测 定后 带 入标准曲 线Y=32.549X-0.224（Y代表蛋白含量，X 代表OD595

3、）,计算得出蛋白含量。可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空 白对照（1ml 蒽酮 +180ul ddH2O ，Y=0.0345X+0.0204（Y 代 表OD625, X代表可溶性糖含量（ug）蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O .浓硫酸加入水中时， 一点一点递加， 小心溅出受伤。丙二醛 （MDA测定：在酸性和高温条件下， 丙二醛可与硫代巴比妥 （TBA反应生 成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收 波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰， 糖与TBA的反应产物在 53

4、2nm处也有吸收， 但其最大吸收波长在450nm处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA含量。MDA的计算公式为：MDA （ umol/L）=6.450D532-0.560D450.反应体系为：400ul0.6%TBA+350ulH20+50ul样品，80C水浴 10min 后，测OD532和 OD45Q对照用 Tris-HCl. 0.6%TBA 配方：称取硫代巴比妥0.6g ,溶于少量1M NaOH中，待其完全溶解 后用10%TCA（称取10gTCA三氯乙酸， 溶于100ml蒸馏水中， 待 其溶解即可）定容至100ml。H2O2 测定（二甲酚橙法）：样品反应体系（82ul溶液A+820ul溶

5、液B（A:B=1:10）+150ul样品提取液），30C水浴30min , 测OD56O标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555（Y 代表 OD56O, X 代表 H2O2含量）测定OD625后带入标准曲线：溶液 A （200ml）:FeSO4.7H2O 0.1835g;（NH4）2SO4 0.0872g ; H2SO4（浓硫酸18M）4.58ml, 加水定容。溶液 B （200ml）:二甲酚橙0.0234g ;山梨醇6g ,加水定容到200ml 3. 可溶性蛋白、SOD POD和CAT活性测定 样品处理：取0.5g样品，速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入 1.5ml 的

6、 Tris-HCl （pH7.0）（内含有 20%甘油、1mmol/L ASA（抗坏血酸）、1mmol/L DTT （二硫苏糖醇）、1mmol/L EDTA、 1mmol/L GSH（还原型谷胱甘肽）、5mmol/L MgCl2） 抽提， 将抽提 液转移到2ml的EP管中，于4C, 12019rpm离心15min ,取上 清，保存在-20C下，上清液可用于可溶性蛋白、SOD POD和CAT 含量测定。1mmol/L 的 ASA 配制：先配制10mmol/L的母液称取176.13mg的ASA,溶于100ml 的Tris-HCl （pH7.0）中即可，然后稀释10倍即可。1mmol/L 的 DTT

7、 配制：先配制10mmol/L的母液称取154.25mg的DDT溶于100 ml 的Tris-HCl （pH7.0）中即可，然后稀释10倍即可。1mmol/L 的 EDTA 配制：用30mmol/L的EDTA稀释30倍即可。5mmol/L 的 MgCI2 配制：称取 MgCI2.6H2O的 101.5mg 溶于 100ml 的 Tris-HCl （pH7.0）， 即可。样品提取液的配制（200ml）：取 10mmol/L 的 ASA 母液 20ml， 10mmol/L 的母液 DTT20ml, 取 30mmol/L 的 EDTA 母液 7ml， 称取 203mg 的 MgCI2.6H2O,最

8、后再量取20ml的甘油，将最终体积定容到200ml，即可。可溶性蛋白测定（Bradford 法）：样品反应体系（800ul H2O+200ulBradford+5ul 样品），空 白对照为（800ul H2O+200ul Bradford ）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224（Y代表蛋白含量，X代表OD595),计算得出蛋白含量。SOD 测定：SOD活性的测定是根据照光时， 体系中产生氧自由基使硝基四 唑蓝还原成蓝色甲(在560nm处有一吸收峰),而超氧化物歧化酶 作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。? 一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半(50 %)时所需的酶量。

9、14.5mmol/L 的dl-甲硫氨酸(分子量149.21 )(现用现配)：称取甲硫氨酸216.4mg,加少量Tris-HCI(pH7.0) 溶解后，用 Tris-HCI(pH7.0)定容到 100ml ,即可。30mmol/L 的 EDTA( 292.25)(现用现配)：称取EDTA药品876.75mg ,加少量Tris-HCl(pH7.0) 溶解后， 用 Tris-HCl(pH7.0)定容到 100ml ,即可。2.25mmol/L 的NBT (硝基四唑蓝)(817.6)(现用现配)：称取NBT药品183.96mg,加少量Tris-HCl(pH7.0) 溶解后，用Tris-HCl(pH7.

10、0)定容到 100ml ,60umol/L 的核黄素(376.36) 先称取225.81mg的核黄素， 溶解后，用 50mMTris-HCl(pH7.4) 的母液，然后取100ul到100ml 制成60umol/L的核黄素。即可。(现用现配)：加少量 50mM Tris-HCl(pH7.4)定容到10ml ,配制成60mmol/L的 Tris-HCl(pH7.4)中，即可配测酶活的反应介质:测定前在54ml的14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸中分别加入EDTA NBT和核黄素各2ml，此为反应混合液。酶活测定：在盛有1.0ml反应液的试管中，加入适量的酶液（50ul）（以抑制达50%作用酶浓

11、度为最佳）。混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱中准确照光10min后，迅速测定560nm处的光密度。以不加酶液照光液的为对照，计算反应被抑制的百分比。按下式计算超氧化物歧化酶的活性 AN酶活力 =AOWTV% 式中：酶活力单位为每min每g鲜重酶活单位数；AO 为对照试管溶液在560nm处的吸光度值； A为对照试管溶液在560nm处的吸光值与加入酶液的反应液在560nm处的吸光值的差；N为酶液总体积；W为提取酶液的样品鲜重 g ; T为照光时间（10min） ; V为加入酶液的体积（ml） ; POD 测定（愈创木酚 法）:过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧

12、化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。反应混合液配制：在 50ml 的 50mmol/L 的 Tris-HCI（pH7.0） 缓冲液中加入 28ul 的愈创木酚，与磁力搅拌器上加热搅拌直至愈创木酚溶解， 再加入 19ul的30%的H2O2, 混合均匀， 4C保存。酶活测定：取反应混合液1.0ml ,加入0.1ml酶提取液，2min前后，于 470nm处测OD值，每隔1min读数一次， 以每分钟OD值的变化 表示酶活大小。（测量时再加入酶液）CAT测定（H2O2法）反应缓冲液：20mM 的H2O2, 使用前在25C水浴中加热30min。酶活测定：取反应液1.4m

13、l ,加入100ul酶液，每加完一管立即计时，并 迅速在波长240nm下测定30S、1min30S、2min30S时的吸光度， 以Tris-HCl 的作为空白。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位。代入酶活力公式，以 OD*V/0.1*v*t FW表示CAT活性，所有 测定均重复三次。 OD代表空白的吸光度-样品管的吸光度；V代表酶提取液的 总体积，v代表测量是加入的样品体积；t代表反应时间min , FW 代表样品鲜重。0.1mol/LH2O2 配方：称取 1.1333g 的 30%的 H2O2, 加入 100ml 的 50mmol/L 的Tris-HCI(pH7.4),即可。也可以用0.01%的H2O24.叶绿素