His蛋白大量纯化

1、1）构建克隆2）转化 BL21 codon plus ，先小摇 50mlBD 管子，双抗， 0.3mMIPTG ，25， 5h （经验值），检测蛋白表达情况，3）挑单克隆于 100ml 培养基中（ 250ml 瓶），至菌液浑浊4） 大摇 2.5L ，分 5 瓶（2L ），每瓶 500ml （上限），每瓶加 15ml 菌液，单抗，测其 OD 值，至 OD600 在 0.6-1.0 之间，取菌液 1ml( 每瓶 200l)， 0.3mM IPTG ，25， 5h5） Lysis buffer 配制：用 50 mlBD 管子，加 5mM(1-5mM) 咪唑（5M储液， PH 8.0 4 避光）除去非

2、特异性， 1mM cocktail ，PMSF 要多加（ 3-4 倍），不可加 DTT （对镍柱不利）、二价离子将菌体取出，融化，按 1L 菌液加 30ml lysis buffer的比例，将菌体充分悬浮（注意吹打时将吸管插入液面以下，减少气泡的大量产生），可分次加入，将菌体转移至 BD 管子中，转移干净菌体悬起后，加入 1%Triton ，1mg/ml 的溶菌酶（1:100 ，可不加），转移至 100ml 小烧杯中，超声处理（一般 200W ，15+15 2000s ）(注意墙头插入液面以下， 避免大量气泡的产生 )，此时菌液由粘稠变得一滴一滴6） 将超声后的菌液转入 50ml 大抽离心管中

3、，配平， 18000rpm 30min 或 14000rpm 15min 2 次7）Beads 处理（可在超声过程中进行， Beads 不能干）：2L 菌体加 4mlbeads ，取 8ml 于 15mlBD 管子中， 500g 3min （1000rpm 5min ），用不含任何东西的 lysis buffer 重悬， Wash2-3 次（10 倍Beads 体积），洗去乙醇，之后分成两份用lysis buffer 浸没，置于4冰库或冰上8）将上清转入50ml 管子中，将Beads 也转入，留少许上清洗Beads ，转移干净， 4 2h，孵育好后，将管子取出，静止一段时间，让 Beads 沉

4、淀，缩短后面过柱子的时间9）先将上清转入柱子中， 再将 Beads 也转入，4，让液体流出，回收存放10）先用 10mM 咪唑的 Lysis buffer洗涤（总体积 100ml ，前 50ml加 1mMPMSF ）（洗涤期间可轻轻吹打Beads ），再用 20mM 咪唑的 lysis Buffer 洗涤（总体积 100ml ，不加 PMSF ）（PMSF 影响抗体制备），Wash 总体积是 Beads 的 50 倍。期间，取 20mM 咪唑的 lysis buffer（Blank ）和洗涤下来的液体（Sample ）测 OD280 ，使其 <0.0111） 洗涤完后，将柱子下端口封住，

5、 用 300mM（250mM-500mM ）咪唑的 lysis buffer 洗（ Elution Buffer ），沿壁加， EP 管接收，每管大约 1ml ，用 bradford 测每管浓度。留下蛋白含量最高的管，呈黄绿色，堵上出口，加 Elution Buffer 浸泡 Beads12） PD10 脱盐柱洗脱咪唑：先将保护液倒掉， 5ml*5 PBS Wash ，将洗脱液按由高到低的浓度梯度， 2.5ml 一组加入 PD10 柱子中，再加 3.5mlPBS 洗脱，一般前 0.5ml 不含蛋白，用 bio-rad 检测后丢弃，接下来 2.5ml 要收集，后面 0.5ml 咪唑较多归入下一组13）大约 3-4PD10 管收集后，用 bio-rad 测浓度（ BSA 对照）14）考染再次测浓度，此时样品和BSA 都做梯度，15） 将样品 500l 分装，做好标记， -80 存放，预定时间，二楼冷冻抽干配制 50mM NaH2PO4,300mM NaCl储液（A），1M imidazole ph=8.0储液Lysis buffer:A+1mM imidazole,ph=8.0 ,用前加 1%tritonx-100,1mM PMSF ,cock tailWash