时间分辨荧光免疫分析法检测C反应蛋白方法的建立及应用

1、时间分辨荧光免疫分析法检测C反应蛋白方法的建立及应用山东医药2010年第50卷第23期时间分辨荧光免疫分析法检测C反应蛋白方法的建立及应用张欣.刘煜盎,薛运周.马雪梅,闫红,钟儒刚(北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124)摘要:目的制备4,7一(氯磺酸基苯基)一1,10一菲哕啉-2,9一二羧酸(BCPDA)鳌合剂,并以其建立时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术检测C反应蛋白(CRP)的方法.方法用二甲基甲酰胺(DMF)溶解自制BCPDA后测定其吸光度;以BCPDA分别标记铕(Eu¨),CRP多克隆抗体制备CRP多克隆抗体-BCPDAEu”荧光标记物;以纳米磁珠为固相载

2、体包被CRP单克隆抗体,分别加入CRP抗原及CRP多克隆抗体-BCPDAEu”,应用六合一板式检测仪检测CRP荧光强度.结果自制BCPDA吸收光谱为220360nm,用337nm的紫外光激发得到CRP多克隆抗体.BCPDA.Eu”的荧光发射光谱,利用TRHA可检测到0.1mg/L的CRP抗原.结论本研究成功制备CRP多克隆抗体一BCPDAEu”荧光标记物并建立了TRFIA检测CRP的方法,此为临床检测CRP提供了新的思路,亦为TR-FIA的推广应用提供了理论依据.关键词:时间分辨荧光免疫分析法;铕;C反应蛋白中图分类号:R392.3文献标志码:A文章编号:1002-266X(2010)23-0

3、026-03Establishmentandapplicationoftime-resolvedfluoroimmunoassayfordetectingCreactiveproteinZHANGXin.LlUYu-yao.XUEYun-zhou,MAXuemei,YANHong.ZHONGRugcmg(CollegeofLifeScienceandBioengineering,BengUniversityofTechnology,Beng100124,P.R.China)Abstract:ObjectiveToprepare4,7-bis(chlorosulfopheny1)一1,10一ph

4、enanthroline-2,9-dicarboxylicacid(BCPDA)chelate,andtimeresolvedfluoroimmunoassay(TRFIA)ofCreactiveprotein(CRP)wasestablished.MethodsBCPDAmadeinourlabweredissolvedanditsabsorptionweredetected;thefluorescentlylabeledprimerCRPpolyclonalantibodyBCPDAEu”waspreparedbylabelingtheEu”,CRPpolyclonalantibodywi

5、thBCPDA;MagneticmicropartieleswereencodedwithCRPmonoclonalantibodies,thentreatedwithCRPantigenandCRPpolyclonalantibodyBCPDAEu,theflu-orescenceintensityofCRPwasdetectedusingPerkinElmerdetector.ResultsTheabsorptionspectraofBCPDAwas220360nm,theCRPpolyclonalantibodyBCPDAEu”fluorescenceemissionspectrawas

6、gotwith337nmUVexcitation,0.1hag/LCRPcouldbedetectedbyTRFIA.ConclusionThefluorescentlylabeledprimerCRPpolyclonalantibody-BCP-DAEu”ispreparedsuccessfullyandtheTRFIAfordetectingCRPisestablishedinthisstudy,whichprovidesnewwaysfortheCRPdetectionandtheoryevidenceforthewideapplicationoftheTRFIA.Keywords:ti

7、meresolvedfluoroimmunoassay;Eu;CreactiveproteinC反应蛋白(CRP)为目前公认的最有价值的急性时相蛋白,但目前常用方法对低水平(0.110mg/L)CRP即超敏一C反应蛋白(hsCRP)的检测受限,而hsCRP与心血管疾病的发生有密切关系J.时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术是在荧光免疫分析基础上,将镧系元素荧光鳌合物的制备与时间分辨技术结合而建立的一种新型技术,具有灵敏度高,不受样品自然光干扰,线性范基金项目:jE京市自然科学基金资助项目(2052005);北京市科委重大项目资助课题(D0906003000091).通讯作者26围宽,标记物稳

8、定,操作简便,无放射性污染等优点,目前国内对其应用主要依赖于国外试剂及试剂盒J.2007年12月,我们采用自制4,7.(氯磺酸基苯基)一1,10一菲哕啉-2,9一二羧酸(BCPDA)鳌合剂制备CRP多克隆抗体.BCPDA一铕(Eu)¨荧光标记物,并建立了TRFIA检测CRP的方法.现报告如下.1材料与方法1.1材料日立U.3010紫外分光光度计及F-4500荧光分光光度计,PerkinElmer六合一板式检测仪,层析柱;BCPDA(自制),氧化铕(EuO,),CRP及抗体,纳米金磁微粒抗体偶联试剂盒,SephadexG-50葡山东医药2010年第5O卷第23期聚糖,其他化学试剂(均为

9、市售分析纯以上),相关缓冲溶液均自制,实验用水为去离子水.1.2BCPDA吸收光谱测定准确称量0.5mgBCPDA,用二甲基甲酰胺(DMF)溶解,用TfisHC1缓冲液(pH=7.8)稀释至0.5mg/ml后置于直径1cm石英吸收池中,以分光光度计测量吸收光谱;将BCPDA储备液用DMF稀释成0.977250g/rrll,在吸收峰值处测其吸光度,获得BCPDA浓度与吸光度的关系方程.1.3BCPDA标记反应及纯化标记Eu¨:将BCPDA溶于pH值9.1的碳酸盐缓冲溶液中,40水浴中温育1h.用pH值为7.8的TfisHC1缓冲液(含Eu”=10mol/L)稀释水解的BCPDA溶液,在

10、37cI=恒温水浴中温育1h,测量其荧光信号.标记CRP多克隆抗体及纯化:取0.1mgCRP多克隆抗体,置pH值9.1的碳酸盐缓冲液860l中衍生,以4ODMF溶解0.1mgBCPDA后分四等份各间隔2min加入,室温连续涡旋反应30rain.采用SephadexC-5O凝胶层析纯化标记的抗体,以0.1m0l/,L,pH值8.0的NH4HCO3按6/min淋洗,300l/,管收集,用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳分析确定抗体位置.合并样品,用Nanosep超滤管浓缩纯化.1.4CRP多克隆抗体一BCPDA与Eu¨反应将ClIP多克隆抗体一BCPDA加入含有Eu&

11、#168;(10moL)及pH值7.8的TfisHC1缓冲液中,37恒温水浴1h进行螯合反应,测荧光光谱.采用SephadexG-5O凝胶层析纯化标记的抗体,同上淋洗及收集,除去标记反应液中游离状态的Eu¨.用SDSPAGE电泳和荧光检测确定CRP多克隆抗体.BCPDAEu¨位置.合并样品,用Nanop超滤管浓缩纯化J.1.5TRFIA检测CRP将CRP单克隆抗体0.1mg包被到0.5mg纳米金磁(GMP)上,并检测其包被效率.将GMP探针以500lPBS重悬,分别加入0,0.1,0.2mg/L的CRP抗原,37震荡反应30min,磁性分离,弃上清,用PBS清洗3次.加人l

12、OlCRP多克隆抗体一BCPDAEu¨,同上震荡,磁性分离及清洗3次.以100lPBS重悬后转移至96孔板上,检测荧光强度.2结果2.1BCPDA吸收光谱BCPDA吸收光谱为220360nm,主要吸收光谱峰为232.95,291.58和325.04nm,证实自制BCPDA结构正确.将BCPDA储备液用DMF稀释成不同质量浓度后在325.1nm处测其吸光度,获得BCDA质量浓度与吸光度在0.977250g/ml的关系曲线,Y=0.0091X一0.0006,R=0.9999.2.2BCPDA的标记反应及纯化BCPDA标记Eu¨:BCPDAEu¨与荧光值对数值的关系方程

13、为Y=24.774X+3.8763.BCPDA标记CRP多克隆抗体及纯化:为得到高标记比和抗体高回收率,本研究BCPDA与抗体质量比为l:1,DNF体积占反应总体积的5%.以洗脱先后为序SDSPAGE分析结果见图1.图1BCPDA标记抗体纯化结果2.3BCPDA.CRP多克隆抗体与Eu¨反应用337nm的紫外光激发得到CRP多克隆抗体一BCPDAEu¨的荧光发射光谱,除589,611nlll外还有一发射带出现,证明CRP多克隆抗体一BCPDAEu螯合物已生成;BCPDA与Eu¨反应后标记抗体检测荧光值为765120(1:10稀释),BCPDA标记抗体后再与Eu&#

14、168;反应检测荧光值为15853581(1:10稀释),故本研究选择第二种方法进行标记.2.3CRP检测结果将CRP的单克隆抗体标记到纳米金磁上,CRP多克隆抗体和Eu¨标记到BCPDA上,利用TRFIA可检测到0.1mg/L的ClIP抗原.3讨论CRP属Oligomefic钙结合蛋白,相对分子质量约120000Da,由5个相同的单体以非共价键构成,经炎性淋巴因子IL_l5,IL一1,肿瘤坏死因子刺激肝脏上皮细胞合成.大多数正常个体的血浆CRP水平均2mg/L,目前临床以3mg/L为正常标准,超过此水平者提示有炎症或心血管等重大疾病发生的可能.以ELISA为主的酶联免疫标记技术为目

15、前临床常规CRP检测方法,灵敏度可达0.15mg/L.本研究结果显示,建立的TRFIA方法可检测到水平为0.1mg/L的CRP抗原.该法测定CRP可行性强,灵敏度高.可能机制:包被单克隆抗体的金磁微粒兼有磁性粒子的超顺磁性及金表面生物分子固定化的性能,不需共价偶联试剂,生物分子通过与磁粒表面静电作用,疏水相互作用,残基侧链的巯基与金的作用等进一步偶联在磁粒表面,可最大限度地保持被偶联分子的生物活性,借助磁性分离器即可完成生物分子的分离,无需分离柱及离心操作;具有超强捕获能力,可有效提高生物分子的利用率.27孵竹抖i.M)BCPDA分子结构可增强荧光作用,无需加增强液,可直接检测稀土标记免疫复合

16、物的荧光.时间分辨技术可使测量样品池和样品中蛋白质等发出短寿命荧光(110BS)完全衰减后再进行检测,分析灵敏度显着增强.此外,本方法不涉及有机试剂,无污染,且有可能实现实验自动化,小型化.综上所述,本研究成功制备CRP多克隆抗体.BCPDAEu¨荧光标记物并建立了TRFIA检测CRP的方法,此为临床检测CRP提供了新的思路,亦为TRFIA的推广应用提供了依据.参考文献:1RidkerPM,HennekensCH,BurringJE,eta1.Ciactiveproteinandothermarkersofinflammationinthepredictionofcardiovasc

17、ulardis-easeinwo腓nJ.NEnglJMed,2000,342(12):836-843.2BiasucciLM,LiuzwG,GrilloRL,eta1.EleavatedlevelsofC-re.activeproteinatdischargeinpatientswithunsatableanginapredict?临床札记?山东医药2010年第50卷第23期recurrentinstabilityJ.Circulation,1999,99(7):855-860.3FergusonRA,HeY,MariaK,eta1.Ultrasensifivedetectionofprost

18、ate-specificantigenbyatime-resolvedimmunofluorometriea8-sayandtheimmuliteimmunochemilumlneseentthird-generationa8?say:potentialapplicationsinprostateandbreastcancJ.ClinicalChemistry,1996,42(5):675-684.4YuanJL,WangG,MajimaK,eta1.Synthesisofaterbiumfluo-rescentchelateanditsapplicationtotimeresolvedflu

19、oroimmunoas?sayJ.AnalyticalChemistry,2001,73(8):18691876.5潘利华,杜继贤,谢文兵.等.时间分辨激光荧光光谱技术在免疫分析中的应用J.光谱学与光谱分析,2000,20(3):277-279.6杭建峰,吴英松,徐伟文,等.超敏c反应蛋白时间分辨荧光免疫分析法的建立J.第四军医大学,2007,28(3):279-282.7高敏,潘利华,任慧娟,等.4,7-(氯磺酸基苯基)一1,10-菲I罗啉-2,9-二羧酸一铕标记甲胎蛋自抗体J.分析化学,2003,31(11):1345-1347.(收稿日期:2010-02-03)皮瓣修复术治疗四肢功能部位

20、深度电烧伤42例李永魁(西安惠安医院,西安710302)四肢功能部位软组织缺损为临床上较常见的外伤,其治疗在外观及功能上均要求较高,通常选用皮瓣修复术.2007年5月2009年5月,我们共为42例四肢功能部位深度电烧伤患者行皮瓣修复术,外观及功能均较满意.现报告如下.临床资料:本组42例四肢功能部位深度电烧伤患者,男30例,女l2例;年龄1664岁,平均33.4岁.创面面积1.0cm×0.9em2.9cmX5.8cm.均于清创后行皮瓣修复术,急诊手术25例,清创后延期手术17例.手术步骤:测量受区面积,设计选取皮瓣,注意使受区皮瓣面积大于缺损皮瓣面积15%以上.本组选择邻指皮瓣4例,

21、游离皮瓣9例,拇指推进皮瓣15例,转轴皮瓣18例,腹部真皮部下血管网超薄皮瓣12例,食指近节背侧岛状皮瓣7例.其中邻指皮瓣选择四肢近节背侧,以桡侧端为蒂至侧中线,切取皮瓣时于尺侧切开皮肤至深筋膜下,呈翻书样翻转皮瓣覆盖四肢腹侧创面,间断缝合上下及桡侧创缘,一般手背及前臂静脉直径多>1i/lm,足背及小腿静脉直径多>2mm;拇指推进皮瓣多沿肢体和静脉长轴设计,两侧避免超过侧中线,近端避免超过远指问关节上横纹,蒂部在关节近侧(不超越关节);全指掌侧推进皮瓣设计时沿拇指两端侧中线自远端向近端纵向切开皮肤达掌指横纹较远处,注意将两侧指固有动脉神经束包含在皮瓣内;腹部真皮下部血管网超薄皮瓣长度(包括28蒂长)与筋膜蒂宽度之比不应超过4:1,静脉筋膜蒂应在关节近侧;食指近节背侧岛状皮瓣切口线设计为”s”形,切取部位为食指近节背侧,