病毒诱导的基因沉默(VIGS)研究进展-

1、园艺学报 2014,41(9:18851894 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 病毒诱导的基因沉默(VIGS研究进展宋震,李中安,周常勇*(西南大学柑桔研究所,中国农业科学院柑桔研究所,重庆 400712摘 要:病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS是一种RNA介导的植物抗病毒机制,近年来已被用作研究植物基因功能的反向遗传学手段。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比,VIGS技术研究周期短,不需要遗传转化,具有低成本、高通

2、量等优势。因此,VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。综述了VIGS的机制、技术发展、沉默效率的影响因素及其在植物基因功能鉴定中的应用,并对VIGS在植物性状改良及植物保护方面的应用前景进行了展望。关键词:病毒诱导的基因沉默;VIGS;功能基因组学;病毒载体中图分类号:Q 943.2;S6 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(201409-1885-10 Research Advances of Virus-induced Gene Silencing(VIGSSONG Zhen,LI Zhong-an,and ZHOU Chang-y

3、ong*(Citrus Research Institute of Southwest University,Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712,ChinaAbstract:Virus-induced gene silencing(VIGSis an RNA-mediated antiviral defense mechanism of plant,and has been developed as a reverse genetics tool for

4、gene function analysis recently. VIGS has many advantages compared to commonly used biotechnological tools such as gene transformation,gene knockout and antisense inhibition. It is rapid with low cost,no need for stable plant transformation,and allows a large-scale screening of genes. Consequently,t

5、he approach has been widely used in many plant species to characterize genes involved in various plant development processes,disease resistance,stress resistance,and metabolic regulation. This paper reviewed the mechanism and current improvements of VIGS,factors affecting VIGS response,and VIGS appl

6、ications on plant functional genomics. Meanwhile, the promising application prospect on crop improvement and plant protection were also discussed.Key words:virus-induced gene silencing(VIGS;functional genomics;viral vector病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS最早用于描述植物受病毒侵染后的症状恢复现象(van Kammen,19

7、97。不过,近年来VIGS已专门用于指通过重组病毒来沉默植物内源基因的反向遗传学技术(Burch-Smith et al.,2004。VIGS技术是利用携带目的基因cDNA片段的病毒载体侵染植株,随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同源基因mRNA收稿日期:20140304;修回日期:20140725基金项目:公益性行业科研专项(201203076;中央高校基本科研业务专项(XDJK2013C161;重庆市科委重点实验室专项(2012GJSZ112 * 通信作者Author for correspondence(E-mail:zhoucy;Tel:023-*1886 园艺学报41卷降解或被甲

8、基化等修饰,从而引起植物表型或生理指标变化,实现对该功能基因的鉴定(Godge et al.,2008;Senthil-Kumar & Mysore,2011b。VIGS技术不需要遗传转化及突变体获取,操作简单,具有速度快、成本低、高通量等优势,因而成为功能基因组学研究领域最具吸引力的技术手段之一(Becker & Lange,2010。目前,VIGS体系不仅在模式植物如本氏烟、拟南芥上成功建立,在小麦、玉米、水稻、番茄、葡萄、苹果、柑橘等作物上的应用也有报道。随着技术的不断成熟和研究的深入,VIGS已广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等相关基因的功能鉴定,在植物性状改良及植物保护等

9、方面也展现出良好的应用前景。关于VIGS的综述文章较多(Lacome,2011;Senthil-Kumar & Mysore,2011b;Zhou & Huang,2012,其内容主要集中于VIGS作用机制、技术进展、优缺点分析及在基因功能鉴定方面的应用等。本文进一步综述了VIGS的作用机制及其沉默效率的影响因素,突出了VIGS技术的最新研究进展,并对其在分子育种和植物保护方面的应用进行了展望。1 VIGS的机制基因沉默在生物中普遍存在,其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵,识别并抑制外源基因表达,维持生物基因组稳定性等(Baulcombe,2004。VIGS作为基因沉默的特殊形式,是

10、植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后,在复制与表达过程中通常会形成双链RNA(Double stranded RNA,dsRNA形式的中间体。dsRNA作为基因沉默关键激发子,首先在细胞中被类似RNase 家族特异性核酸内切酶Dicer类似物(如DCL4切割成21 24 nt的小分子干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA(Llave,2010。siRNAs在植物细胞内被依赖RNA的RNA聚合酶1(RNA-dependent RNA polymerase 1,RDR1、RDR2或RDR6进一步扩增(Donaire et al.,200

11、8,并以单链形式与Agronaute1(AGO1蛋白等结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC,RISC特异地与细胞质中的同源RNA互作,导致同源RNA降解,从而发生转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS (Brodersen et al.,2008;Qu & Morris,2008;Llave,2010;RISC特异地与细胞核内同源DNA相互作用导致其被甲基化等修饰,从而发生转录水平的基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS (Zh

12、eng et al.,2007;Llave,2010。2 VIGS技术的发展2.1 VIGS载体病毒范围拓宽RNA病毒是建立VIGS体系时最早采用的载体病毒,也是目前应用最多的载体病毒种类。1995年,Kumagai等(1995首次完成了基于烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV的VIGS载体构建,当携带八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDScDNA片段的重组病毒侵染烟草后,接种上位叶片出现褪绿白化现象,并伴随着PDS mRNA水平的显著降低。由于PDS是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶,当PDS表达受阻时,植物便丧失了类胡萝卜素的光保护作用

13、,从而呈现出白化效应。1998年,Ruiz等(1998利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX构建了VIGS 载体,通过沉默PDS基因同样诱发了白化效应。由此,研究者意识到VIGS可以有效地抑制植物内源基因的表达,并提出利用病毒载体进行未知基因功能鉴定的新技术途径。随后,基于烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV的VIGS载体体系构建成功(Ratcliff et al.,2001,因其具有病毒9期宋震等:病毒诱导的基因沉默(VIGS研究进展 1887症状较轻、沉默效率高、持续时间长及能够侵染分生组织等优点,在模式植物本氏烟、拟南芥以及番茄、马铃薯、辣椒、矮

14、牵牛、棉花等多种植物上得到应用,是目前应用最为广泛的VIGS载体(Huang et al.,2012。DNA病毒用于VIGS具有载体构建简便、无需体外转录及操作难度低等优点。1998年,基于双生病毒番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus,TGMV的VIGS体系成功建立(Kjemtrup et al.,1998,这是第一例DNA病毒载体。随后,基于非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV和棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV的VIGS体系相继构建成功,并在木薯和棉花中得到应用,促

15、进了木薯和棉花的功能基因研究(Fofana et al.,2004,Tuttle et al.,2008。最近,水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus,RTBV也被改造为VIGS载体,通过农杆菌介导接种实现了水稻内源基因PDS的高效沉默(Purkayastha et al.,2010,这是第1例能够通过农杆菌介导接种水稻的VIGS载体。卫星病毒由于具有基因组小,在植物中复制水平高且容易遗传操作等特点,成为一种优良的候选VIGS载体。继RNA病毒和DNA病毒作为VIGS载体之后,基于卫星病毒的VIGS体系也得到了开发。2002年,Gossel等(2002首

16、次完成了对伴随TMV U2株系的卫星病毒STMV的VIGS 载体化改造,并成功实施了对烟草PDS等多个植物内源基因的沉默。周雪平教授的研究团队先后报道了基于中国番茄黄化曲叶病毒卫星Betasatellite(即DNA 和基于烟草曲茎病毒卫星Alphasatellite (即DNA1的VIGS载体(Tao & Zhou,2004;Cai et al.,2007;Huang et al.,2009;Zhou & Huang, 2012。上述载体在烟草、番茄和矮牵牛等多种作物上都能够诱导高效的基因沉默。2.2 VIGS应用寄主的拓展虽然VIGS在基因功能研究方面展现出很大的优势,但VIGS载体病毒的

17、寄主范围有限,针对不同的寄主植物往往需要开发不同的病毒载体。以往多数VIGS系统都基于模式植物本氏烟建立,尽管对VIGS的机理等研究起到极大的促进作用,但针对经济作物构建新的VIGS系统则更具实际应用价值。Holzberg等(2002以大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV为载体,首次在单子叶植物大麦上成功抑制了PDS基因的表达,并进一步在小麦上得到应用(Scofield & Brandt,2012。2006年,利用多组分病毒菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV在大豆上成功建立起VIGS体系(Zhang & Ghabri

18、al,2006,此载体经过改造不再需要进行体外转录,显著地增加了沉默效率(Zhang et al.,2010,最近又进一步应用于大豆与根部微生物的互作研究(Kandoth et al.,2013。2006年,Ding等(2006报道了可用于水稻、大麦和玉米的雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV载体。果树往往童期长,遗传转化困难,制约了基因功能研究的进展。而VIGS技术则有望克服上述瓶颈从而大大促进相关基因的功能鉴定。基于苹果潜隐球状病毒(Apple latent spherical virus,ALSV构建的VIGS载体,能够高效诱导苹果、梨、番茄等的基因沉默(Sasak

19、i et al.,2011。随后,葡萄的VIGS体系也构建成功(Kurth et al.,2012。2012年,基于柑橘叶疱斑病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV的柑橘VIGS体系构建获得突破,通过农杆菌介导首次实现了柑橘内源PDS基因和Su基因的沉默(Agero et al.,2012。由于CLBV在多数柑橘种类中不表现症状,作为VIGS载体和基因表达载体在柑橘基因功能研究中具有良好的应用前景。2.3双元VIGS载体构建双元VIGS载体并通过农杆菌介导方式进行重组病毒接种,是VIGS技术发展和优化的一个里程碑式进展(Lacomme,2011。该方法以既能在大肠杆

20、菌中繁殖又可以通过农杆菌转化植物的1888 园艺学报41卷双元载体,如以pCAMBIA、pGreen等为基础,首先将病毒全长cDNA克隆到真核启动子及终止子之间,再将其植入到载体T-DNA的左右臂之间。这样,当双元载体通过农杆菌介导转化植株以后,在寄主细胞内通过真核启动子转录出病毒的侵染性克隆,随着病毒的复制与移动,其携带的基因片段便可诱导同源基因的系统沉默。这种方法避免了体外转录,大大降低了成本,并且适合于高通量开展基因功能的沉默鉴定(Burch-Smith et al.,2004;Meng et al.,2009。另外,该技术与免连接克隆(Ligation-free cloning方法结合

21、使用,非常有利于大规模cDNA的功能鉴定(Liu et al.,2002; Dong et al.,2007。2.4 可遗传的VIGSVIGS可以分为两种类型,即转录后水平的基因沉默(PTGS和转录水平的基因沉默(TGS (Jones et al.,1998;Sonoda & Nishiguchi,2000;Kanazawa et al.,2011。最近的研究发现,靶基因启动子甲基化引发的TGS是可遗传的(Kanazawa et al.,2011。例如,通过黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV载体对靶基因启动子的甲基化,分别实现了矮牵牛和番茄相应基因的TGS,而其后

22、代植株继续表现为该基因的沉默表型(Kanazawa et al.,2011。由于病毒RNA没有整合到植物基因组,病毒诱导的TGS被归类为非转基因,利用这种方法获得的植株沉默性状可以遗传,并且后代植株既不是转基因植株,也不需要携带病毒载体(Vainstein et al.,2011。最近的研究发现,部分VIGS载体病毒诱导的PTGS能够通过种子传递给后代植株(Bruun-Rasmussen et al.,2007;Yamagishi & Yoshikawa,2009;Senthil-Kumar & Mysore,2011c,并且植株的遗传基因并未发生改变。BSMV介导的VIGS被证明能够在大麦和

23、小麦中至少传递6代(Bruun-Rasmussen et al.,2007,第1代观察到的沉默率为11%,而第3代及以后各代沉默率均为100%。ALSV介导的大豆VIGS在第1代沉默率为33%,而在下一代沉默率达到55%以上(Yamagishi & Yoshikawa,2011。目前应用范围最广、基于TRV的VIGS载体也被证明能够在本氏烟和番茄中诱导可遗传的PTGS(Senthil-Kumar & Mysore,2011c。2.5小RNA诱导的基因沉默(MIGS小RNA诱导的基因沉默(miRNA-induced gene silencing,MIGS是通过病毒载体介导在植物中表达microR

24、NA(miRNA实现对靶基因沉默的一种VIGS新技术。由于参与了miRNA通路故而有效地提高了基因沉默的特异性,该技术使更为精准的基因敲除成为可能(Tang et al.,2010。研究表明,与插入更长的反义cDNA片段相比,通过甘蓝曲叶病毒(Cabbage leaf curl geminivirus, CbLCV载体表达miRNA诱发的靶基因沉默具有更高的沉默效率(Lacomme,2011。最近研究发现,基于TRV的MIGS可以诱发线虫启动RNA干扰机制,证明通过VIGS可以抑制病原线虫体内相关基因的表达(Valentine et al.,2007;Dubreuil et al.,2009。

25、这为深入研究植物病原物的互作机制以及将RNA沉默应用于植物保护提供了新途径(Lacomme,2011。2.6寄主诱导的基因沉默(HIGS2010年,Nowara等(2010利用基于BSMV的VIGS载体在小麦体内实现了对小麦白粉病菌(Blumeria graminis基因GTF1和GTF2的沉默,对白粉菌侵染钉的生长产生显著影响,因此提出利用VIGS鉴定植物病原基因功能的新途径,并首次提出了寄主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS概念,从而将VIGS的沉默对象从对寄主植物基因拓展到植物病原物内源基因。HIGS是对 VIGS 的进一步发展,它通过基因工

26、程手段或病毒载体在寄主植物细胞中引入病原物基因片段(通常构建为发卡结构,导致针对特定病原物核苷酸序列的dsRNA产生,进而形成siRNA,9期宋震等:病毒诱导的基因沉默(VIGS研究进展 1889当寄主植物受到侵染时,诱导靶标病原物内源基因的沉默,从而鉴定病原物基因功能或降低病原物为害。作为一种全新的研究植物病原物与寄主互作的工具,HIGS在病原真菌的基因功能研究和病害控制方面具有广阔的应用前景(Nunes & Dean,2012。3 影响VIGS效率的因素良好的沉默效率是VIGS体系应用的前提,也是科技工作者的研究方向。VIGS沉默效率很大程度上依赖于病毒与寄主植物的相互作用以及适于寄主良好

27、生长及病毒积累的环境条件(Burch-Smith et al.,2004。首先,插入片段与靶基因的同源性显著影响VIGS的效率。由于VIGS的作用机制基于核苷酸序列同源性,两者序列同源性越高,基因沉默效果越好(Thomas et al.,2001;Burch-Smith et al., 2004。基因片段如果选择不当可能会造成基因沉默的“脱靶”(Off-target Silencing,从而得不到有效的沉默表型(Xu et al.,2006;Senthil-Kumar & Mysore,2011a,当VIGS产生的siRNA与靶标mRNA的一致序列少于11 bp,基因沉默的几率会大大降低(Se

28、nthil-Kumar et al.,2007。通过“siRNA-scan”等生物学软件进行序列比对与筛选可以预测和有效提高沉默效率(Xu et al.,2006。另外,植物中许多基因以家族形式存在,若要沉默基因家族的多个基因,一般应选择该基因家族的保守区以防止不同基因之间的功能互补而达不到良好的沉默效果(Jacob et al.,2003;如果只想沉默家族中的特定基因,就应在其特异序列上选取靶基因片段。其次,靶基因片段的长度、插入方向、组织方式等可能会对沉默效率产生影响。研究表明,要达到比较好的沉默效果,插入病毒载体的基因片段长度应该控制在200 350 bp之间(Burch-Smith e

29、t al.,2006;Liu & Page,2008;Zhang et al.,2010;Rodrigo et al.,2011。如果片段大于1.5 kb,大部分载体很可能会丢失插入片段,或者失去系统侵染能力,从而失去诱导基因沉默的功能(Burch- Smith et al.,2004。一般而言,靶基因片段反向插入VIGS载体比正向插入诱导的基因沉默效率要高。但某些VIGS病毒载体,如DNA的沉默效率则不受插入方向的影响(Tao & Zhou,2004。另外,将靶基因片段构建成反向互补的形式插入载体病毒,转录时形成发卡结构(Hairpin会显著地提高基因沉默效率(Lacomme & Hrubi

30、kova,2003;Pflieger et al.,2008。再次,环境因素直接影响病毒在植物体内的积累、传播和植物生长,因此植物培育条件与VIGS 沉默的效果密切相关(Burch-Smith et al.,2004。温度是影响VIGS沉默效率最重要的因子之一(Szittya et al.,2003;Tuttle et al.,2008。有效沉默的适宜温度因病毒载体和宿主植物不同而不同。一般情况下,高温环境会导致植物体内病毒含量显著降低,基因沉默的效率亦明显降低;而在较低的温度条件下,病毒的含量和基因沉默的效率都显著地上升。例如,应用TRV病毒载体在番茄中实施基因沉默时,要获得比较好的沉默表型

31、,环境温度要低于21 ,高于28 时TRV介导的VIGS 几乎完全被抑制(Tuttle et al.,2008。有一些病毒载体则对温度有良好的适应性,环境温度在较宽的范围内变化时沉默效率受影响不大。如卫星病毒载体DNA和DNA1,二者在22 32 环境中都能高效诱导基因沉默(Cai et al.,2007。湿度对VIGS沉默的效果也有影响,相对较低的湿度有利于TRV介导的VIGS(Fu et al.,2006。另外,VIGS病毒载体的接种方法对基因沉默效率具有不同程度的影响。摩擦接种、微粒轰击及农杆菌介导接种是目前实施VIGS常用的方法。其中,农杆菌介导接种侵染效率高,成本低廉且操作简便,因而

32、应用最为广泛(Lacomme,2011。为了获得更好的VIGS沉默效率,针对不同植物及病毒载体,农杆菌接种方式得到了进一步的改进,比如注射法(Agero et al.,2012、灌根法(Ryu et al.,2004、高压喷枪法(Fu et al.,2005、真空浸润法(Ding et al.,2006等。最近建立的幼芽真空浸润法(Sprout vacuum-infiltration(Yan et al.,2012更为简单、高效,更适宜于大规模VIGS 应用。而在番茄、草莓和越橘离体果实中直接注射诱发基因沉默的成功,为果蔬采摘后相关基因的研究提供了良好的技术手段(Romero et al.,2

33、011。另外,在用农杆菌介导接种时,通过局部共表达基因沉默抑制子可以显著提高基因的沉默效率(Rodrigo et al.,2011。4 VIGS的应用及展望VIGS作为植物基因功能鉴定的一种反向遗传学新技术,与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比,不需要繁杂的突变体筛选及转基因植株的获取,操作简便,获得表型快,成本低廉。同时,VIGS具有高通量的优势,且能够应用于细胞基本功能或发育早期相关基因的功能鉴定。因此,VIGS技术一经诞生便得到了广泛的应用。其中,植物抗性相关基因的功能鉴定是VIGS 技术应用的热点之一,包括抗病毒(Chen et al.,2013、真菌(Gao et al

34、.,2013、细菌(Maimbo et al.,2010、昆虫(Mantelin et al.,2011相关基因,以及逆境抗性相关基因(Manmathan et al.,2013等。VIGS技术不需要转基因,因而在发育相关基因研究上具有优势,被认为是植物苗期致死相关基因功能鉴定的最佳手段(Becker & Lange,2010。迄今已利用VIGS技术鉴定分析了蝴蝶兰(Hsieh et al.,2013及罂粟(Hands et al.,2011的花形态建成、棉花纤维发育(Qu et al.,2012、果实成熟(Jia & Shen,2013及筛管发育(Jin et al.,2006相关基因等。利

35、用VIGS还研究鉴定了植物许多代谢途径相关的功能基因,其中包括植物甾醇及吡咯生物合成(Luo et al.,2013、光合作用代谢途径、纤维素及木质素合成、淀粉代谢(George et al.,2012等相关基因。随着拟南芥、水稻、柑橘(Xu et al.,2012等植物基因组计划的完成以及番茄、马铃薯、大豆、小麦、玉米等基因组序列信息的快速累积,VIGS将以其周期短、成本低、高通量等优势拥有更为广阔的应用前景。在更多寄主,尤其是果树等童期长、转基因困难、常规方法较难进行基因功能研究的园艺作物上,建立高效稳定的VIGS体系将是未来研究的方向之一。相信随着VIGS机制的深入解析及相关分子生物学技

36、术的进步,能够有效克服VIGS存在的一些弊端和不足,如基因沉默不完全、沉默效率及表型不稳定、易受病毒侵染症状影响等,从而建立更为精准、更加高效和更高通量的VIGS技术体系,更好地开展功能基因组学研究。除了基因功能鉴定,VIGS技术在植物基因工程及分子育种上展现出良好的应用前景。研究表明,VIGS载体病毒可以诱导寄主植物可遗传的转录水平及转录后水平基因沉默(Vainstein et al., 2011。VIGS这种非转基因但能够稳定遗传的特性具有很高的应用价值。通过VIGS沉默作物优良性状负调控基因、代谢途径关键酶基因可能快速实现植物重要经济性状的改良。例如,通过大麦条纹花叶病毒载体沉默TaLS

37、D1基因可以提高小麦对条锈病的抗性(Guo et al.,2013,而该载体是可诱导遗传性转录水平沉默的一种载体,相关技术进一步优化后便可能应用于培育非转基因但抗性增强的改良品种。另外,通过VIGS沉默晚花基因型水稻的开花负调控因子(Purwestri et al.,2009使其同早花基因型水稻的杂交成为可能。同时,缩短播种至开花的时间还有助于加速育种进程(Yamagishi & Yoshikawa,2011。VIGS技术还可应用于提高一些不适于农杆菌介导遗传转化植物的遗传转化率。例如,当农杆菌介导遗传转化的负调控因子被沉默以后,所得植株的外植体便可用于稳定的遗传转化(Gelvin,2010。

38、此外,VIGS技术有望开辟植物保护新途径。寄主诱导基因沉默概念的提出及其应用实践表明, VIGS不仅可以作用于植物内源基因,在寄主体内也可实现对病毒、真菌、线虫等病原基因的沉默。因此,利用重组特异序列的VIGS载体接种植物可用于对真菌、线虫等病害的防控(Kurth et al.,2012; Nunes & Dean,2012。研究证实,携带绿色荧光蛋白基因(GFP的TRV载体可以诱发基因沉默,介导对PVX-GFP的抗性;而PVX-GFP也可以介导对携带GFP基因片段CMV的抗性(Ratcliff et al., 1999。因此,通过装载目标病毒有关基因,VIGS载体有望开发为抗病毒疫苗,具有良

39、好的应用前景。最近的报道还显示,在寄主植物中,VIGS载体能够沉默小麦条锈病菌致病基因的表达,从而显著降低其为害(Panwar et al.,2013;应用VIGS技术也可以抑制植物病原线虫相关基因的表达(Valentine et al.,2007;Dubreuil et al.,2009,这均为基于VIGS开发植物保护新途径提供了选择。ReferencesAgero J,Ruiz-Ruiz S,del Carmen Vives M,Velzquez K,Navarro L,Pea L,Moreno P,Guerri J. 2012. Development of viral vectors

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