一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项

1、-文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：“想拿 高分文章，不学免疫组化怎么行？ ”免疫组化王子毛博旁边 插话：“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和 经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位 前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry）, 是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来 确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫 组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括 石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片， 对组织形态保存好，保存时间也长

2、，虽然对组织抗原暴露有 影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制 作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候， 我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却 不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾 事。如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色, 阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳 性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机20 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染 色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐 色）和阳性范围（1分0-25%, 2分26-50%, 3分51-75%, 4 分76

3、-100%）评分，最终分数相加。免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门 绝技。1对照染色和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须 设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。 对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照， 自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织 对照就足够了。2 定位抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上； CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内 等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性 结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么 办？这就要用到上一段提到的对照染色了。3 半定位现

4、在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不 幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下 量了。因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫 组化的半定量一般就分为三级：弱（ + ）,中（+）,强（+卄）。 以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光 和亮绿色耀眼荧光。弱（+ ） =1,中（+） =2,强（卄+） =3o 至少随机观察540个HPF。然后根据（+ ） %xl+ （+） %x2 + （+） %x3计算出数值；总数值25者为（+）。4图像分 析仪如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。图像 分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重 推荐的是一

5、款图像分析软件:image Jo毛博当年在米国做博 士猴的时候，就是用的这款软件。这是NIH开发的免费软件。 一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发 到了 1.50版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图 所示。现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图 像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照 片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先，要 把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下：ImageType 16-bito转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。 步骤如下：ImageAdjustThreshold。然后拖动鼠标，直到 所有的细

6、胞被标示岀来。有时候2个细胞靠得比较紧密，会 被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。 步骤如下：Images Binary-* Watershed。如下图的蓝色箭头 所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加 精确地被计数成了 2个细胞。然后，就可以正式开始分析了。 步骤如下：AnalyzeAnalyze Particles。在得出最后的结果之 前，还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞，那 么Size项里面选择“Oinfinity”。Circularity的默认值为"0.00-1.00"o 一般就取默认值。最后的结果如下图所示。软 件

7、自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以 就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面 积为21286.00,平均大小为295.64o免疫组化是个苦活，时 间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦 染岀了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的结果。以上, 毛博介绍了一些自己的心得体会。希望广大的实验狗们都能 做出自己想要的结果，早点发文章。非特异性染色的八大 原因然而，结果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种 状况，好好的一张片子染得脏脏的，这就是最常见的非特异 性染色。1.抗体问题，真的是一分钱一分货啊！一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯 度，高效

8、价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解 决。单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。尤其是背景非特 异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造 成杯具，所以要注意抗体的有效期。2.抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也是出现 非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使 用新抗体前应该多做预实验，摸索出最理想的工作浓度，不 能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过 长。解决的办法就是定时器。加上抗体后，立刻调好定时器, 提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。3. DAB染色时间太长/变质DAB的孵育时间过长，会造 成背景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不

9、变的，主 要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就 要马上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出 现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光 干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。图1就冲洗 的有些晚了；图2就是刚刚好，染色效果棒棒哒!4.内源性 酶和生物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别 是一些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾 脏等。处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将 左旋咪卩坐（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2, 即能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以 用50 mmol/L的

10、酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以 用0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片 浸于25 H g/mL亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后 即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分钟。5.组织变干一下子染太多片子的时候，容易岀现这种情况。解决的 办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充 分覆盖组织，超出组织边缘2mmo然后用PAP笔在组织周 围画一个圈圈，把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈 应该距离组织边缘3-4 mmo 6.浸泡时间过长切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。 这都是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。毛博 的独门秘技就是4。C冰箱。只要把容器放在4。C冰箱里， 过夜完全没有问题。7. 清洗不充分清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配，用之前再 次测PH值。缓冲液用0.05 mol/L的TrisHCL, 0.15 mol/L的 NaCI即可。如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。8. 封闭血清问题是否