食用菌中多种氨基甲酸酯类农药残留的超高效液相色谱-串联质谱法测定研究

1、食用菌中多种氨基甲酸酯类农药残留的超高效液相色谱-串联质谱法测定研究赵颖蒋施金雁姚家彪刘瑜徐宜宏钟钰吕红英李梅(沈阳出入境检验检疫局综合技术中心沈阳10016摘要建立了同时测定食用菌中19种氨基甲酸酯类农药(NMCs残留的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS。通过丙酮和乙腈(8515,V/V提取,GPC法和PSA固相萃取柱两种方法净化,UPLC-MS/MS同时测定蘑菇、香菇、木耳和牛肝菌中19种氨基甲酸酯类农药,同位素稀释法定量。以GPC法净化,回收率为74.0% 93.2%;以PSA固相萃取柱净化,回收率为70.2% 91.8%,两种方法的检出限均为0.01mg/kg。各种NMC

2、s在确定的添加范围内线性关系良好,线性相关系数R均大于0.99。所建立的检测方法实用、准确、灵敏度高。关键词食用菌氨基甲酸酯超高效液相色谱-串联质谱GPC PSAStudy on UPLC-MS/MS Method for Determination of CarbamatePesticide Residue in MushroomsZhao Ying,Jiang Shi,Jin Yan,Yao Jiabiao,Liu Yu,Xu Yihong,Zhong Yu,Lv Hongying,Li Mei(Technology Center,Shenyang Entry-Exist Inspecti

3、on and Quarantine Bureau,Shenyang110016Abstract Methods to simultaneously determine19carbamate pesticides residues in mushrooms by liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MSwere establishedThe mushroom samples were extractedwith acetone/acetonitrile(8515,V/V,purified by gel permeation

4、 chromatography(GPCor solid phase extraction(SPEand detected by UPLC-MS/MS with isotope internal standard methodResults showed that the recoveriesranged from74.0%to93.2%with the cleaning method of GPC and70.2%to91.8%with the cleaning method ofPSA solid phase extractionThe limits of detection(LODwas0

5、.01mg/kgThe method showed a good linearrelationship with the correlation coefficients over0.99The established method is applied,accurate and highsensitiveKeywords Mushrooms,Carbamate,UPLC-MS/MS,GPC,PSA氨基甲酸酯类农药(carbamates,NMCs是一类广谱杀虫、杀螨、除草剂,由于其具有高效、残留期短的优点,在食用菌种植中广泛应用。国际上对NMCs在食用菌中残留限量最低为0.01mg/kg。在N

6、MCs 残留分析中,仪器检测常采用GC-NPD1,2、GC-MS3,4、HPLC-VWD5、HPLC-FLD6,7、HPLC-MS7,8等。其中,由于灵敏度和柱效的原因,HPLC-VWD和HPLC-FLD法不适合多残留同时定性定量分析。毛细管GC-MS具有高的分离和确认能力,但不适合热不稳定化合物的分析。与以上各种检测方法相比,液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS在检测兽药残留,尤其是多种兽残方面,有其显著的优点。液相色谱与串联质谱联用可在一级质谱条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰,并可对准分子离子进一步裂解,获得子离子峰,进而可排除基体干扰,准确辨别目标化合物。因此,LC/MS/MS检

7、测方法具有灵敏度高、进样量少、基体干扰小等优点,目前已经成为国内外较为先进且积极推广使用的仪器检测方法。UPLC使用比普通HPLC颗粒度更小的色谱柱填料,能够获得更高的柱效、节省分析时间和增加峰容量,赵颖女,33岁,工程师,从事食品中农兽药残留分析研究。E-mail:zy-ciq163com“十一·五国家科技支撑计划“课题”农药与兽药残留确证检测技术研究”项目(2006BAK02A08005资助2011-03-20收稿,2011-07-18接受能够提供比HPLC更快、更灵敏的LC/MS/MS分析。文献报道中,对NMCs残留进行检测,普遍选择蔬菜和水果作为研究对象,专门针对食用菌类产品

8、研究较少,且净化方法较为单一,检测仪器多为GC、HPLC和GC-MS。本文在对国内外同类研究技术进行比较后,建立了丙酮和乙腈混合溶液提取,GPC法和过PSA固相萃取柱法2种方法净化,UPLC-MS/MS检测,同位素稀释法定量同时测定蘑菇、香菇、木耳和牛肝菌4种有代表性的食用菌中的异丙威、甲硫威、残杀威、猛杀威、速灭威、仲丁威、乙霉威、苯胺灵、氯苯胺灵、涕灭威、灭多威、杀线威、克百威、噁虫威、抗蚜威、甲萘威、杀螟丹、草达灭、硫双威残留量。1材料与方法1.1试剂、标准品与仪器NMCs标准品19种:异丙威、甲硫威、残杀威、猛杀威、速灭威、仲丁威、乙霉威、苯胺灵、氯苯胺灵、涕灭威、灭多威、杀线威、克百

9、威、噁虫威、抗蚜威、甲萘威、杀螟丹、草达灭、硫双威,纯度99%(中国科学院农业环境保护研究所;甲醇、乙腈,色谱纯,美国Dikma公司;其余试剂均为分析纯;实验用水为超纯水。Acquity型超高效液相色谱仪(美国Waters公司;Quattro Premier XE型质谱仪(美国Waters公司;Rapidvap型快速浓干仪(美国LABCONCO公司;LD4-2A型离心机(北京雷勃尔公司。液相色谱条件:色谱柱:Waters C18柱(100mm2.1mm id,1.7m;柱温:40;样品室温度:室温;进样体积: 10L;流速:0.2mL/min;流动相:甲醇(A和0.1%甲酸水溶液(B,梯度洗脱

10、,条件见表1。质谱条件:电离方式:ESI+;电离电压3.0kV;离子源温度110;锥孔反吹气流量80L/h;脱溶剂气温度300;脱溶剂气流量500L/h。监测模式:采用MRM模式。各NMCs农药的检测离子详见表2。表119种氨基甲酸酯类农药的梯度洗脱条件Tab.1Gradient program of LC时间/min甲醇/%0.1%的甲酸水溶液/%0109015.0901016.0901018.01090表219种氨基甲酸酯类农药的检测离子及碰撞能量的优化结果Tab.2MS parameters of19carbamate pesticides农药母离子子离子(碰撞能量/eV2前处理方法2.

11、1提取称取20.0g样品,置于100mL离心管中,加入40mL丙酮/乙腈(体积比8515(干木耳样品先加入10mL水,浸泡30min,再加入上述溶液,用10.0mol/L NaOH溶液调节提取液pH9 10,均质提取3min,以4000r/min离心5min,上清液转移至快速浓干管中,于35快速浓缩除去有机溶剂。于上述溶液中加入50mL50g/L NaCl溶液后,依次用25、20、15mL二氯甲烷萃取,萃取液用10g无水硫酸钠脱水后,于35快速浓缩至干,残渣用GPC流动相溶解或固相萃取柱上样液溶解,待净化。2.2净化净化步骤:将“2.1提取”残渣用10mL GPC流动相溶解,经GPC净化,收集

12、流出液于快速浓干管中,于35快速浓缩至干,残渣用1mL甲醇/水(体积比28溶解,过0.2m膜,供液相色谱串联质谱仪测定。2.3UPLC-MS-MS定性和定量定性分析时每种农药选择1个母离子和2个子离子,在相同实验条件下进行样品测定,如果色谱峰的保留时间与标准品一致(偏差在2.5%之内,并且在扣除背景后的样品所选择离子均出现,而且所选择的离子相对丰度比与浓度相近的标准样品中的离子相对丰度比一致(相对丰度比50%时,允许20%的偏差;相对丰度比20% 50%时,允许25%的偏差,相对丰度比10% 20%时,允许30%的偏差;相对丰度比10%,允许50%的偏差,则可判定为样品中存在该NMCs。采用内

13、标法进行定量测定。内标物为D6-抗蚜威。为减少基质的影响,定量采用基质混合标准工作溶液。根据样液中被测农药预估含量选定浓度相近的基质混合标准工作溶液,基质混合标准工作溶液和待测样液中农药的响应值均应在仪器检测的线性范围内,对混合标准溶液与样液等体积参插进样测定,内标法定量。3结果与分析3.1方法的线性范围和定量限在本方法所确定的色谱、质谱条件下,对19种NMCs的线性范围进行了测定,以峰面积对浓度作曲线,19种NMCs的线性范围0.05 10.0mg/L,相关系数R在0.9954 0.9998之间,线性关系较好,信噪比(S/N10时的方法添加浓度确定为本方法定量限,实验表明19种NMCs的定量

14、限均为0.01mg/kg。定量限满足国际上对氨基甲酸酯类农药残留限量的最严格要求。3.2方法的准确度与精密度在空白食用菌样品中添加浓度分别为0.01、0.05、0.5mg/kg的19种NMCs混合标准溶液,按照本方法进行提取、净化和测定。可以看出,采用GPC法净化,4种食用菌中19种NMCs浓度为0.01 0.5mg/kg时,回收率74.0% 93.2%,相对标准偏差1.98% 13.83%;采用PSA固相萃取柱净化,4种食用菌中19种NMCs浓度为0.01 0.5mg/kg时,回收率70.2% 91.8%,相对标准偏差2.20% 13.34%,见表3。结果表明,回收率和精密度的结果满足方法学

15、要求。GPC法和PSA固相萃取柱净化适合于全部19种氨基甲酸酯类农药。表319种氨基甲酸酯类农药的回收率和精密度范围Tab3Recovery and precision range农药GPC PSA回收率/%相对标准偏差/%回收率/%相对标准偏差/%4讨论4.1农药的选择研究中选择的NMCs在食用菌类生产中较为常用9,且世界各国均有残留限量要求10,经过优化后,最终确定出19种NMCs。4.2样品基质的选择对常见的食用菌,按照水分75%,水分75%、糖分5%和水分75%、糖分5% 15%3个条件11进行分类选择,最终确定蘑菇、香菇、木耳和牛肝菌为待测样品基质。4.3色谱条件的优化NMCs结构中

16、含有氨基且易溶于甲醇,故选择甲醇、水和甲酸的混合体系作为流动相。调节流动相中甲酸的含量分别为0、0.1%、0.2%、0.3%,考察氨基甲酸酯类药物的测定情况。实验结果表明,流动相中甲酸含量在0.1%以上时,随甲酸含量的增大,待测NMCs的响应值无明显变化,故确定流动相体系组成为甲醇和0.1%的甲酸水溶液。为了节省检测时间,选择了梯度洗脱的模式。在已建立的分析条件下,20种农药中的大部分农药都能得到较好的分离,峰形对称,与其他峰没有重叠,总离子流色谱图如图1所示。在该分析条件下,有少量待测农药,如噁虫威和克百威、乙霉威和仲丁威、氯苯胺灵和草达灭,由于化合物结构类似、极性相近等原因,在总离子流图上

17、色谱峰发生重叠,但由于化合物间分子量不同,质谱可用多反应监测模式对其进行分离测定,在多反应监测色谱图上化合物间彼此独立互不干扰。4.4质谱条件优化对同一浓度的待测NMCs分别用APCI+和ESI+两种电离模式进行检测,比较各待测农药的响应值,结果采用ESI+电离模式待测农药的响应值均比APCI+电离模式高,故选择在ESI+电离模式进行质谱分析。在ESI+电离模式下,首先采用1g/mL的19种NMCs标准溶液以流动注射的方式进行母离子全扫描,调节电离电压和锥孔电压,确定各NMCs的分子离子,然后对其子离子进行全扫描,优化子离子及碰撞能量,确定其中丰度较强的2个子离子作为监测离子。在优化的液相色谱

18、和质谱条件下,19种NMCs 及内标物的总离子流色谱图见图1。 图119种氨基甲酸酯类农药及内标物的总离子流色谱图Fig.1LC-MS /MS chromatogram of 19carbamate pesticides and internal standard(a-杀螟丹;b-杀线威;c-灭多威;d-D6-抗蚜威b ;e-抗蚜威;f-涕灭威;g-速灭威;h-残杀威;i-噁虫威;j-克百威;k-甲萘威;l-硫双威;m-苯胺灵;n-异丙威;o-乙霉威;p-仲丁威;q-甲硫威;r-猛杀威;s-氯苯胺灵;t-草达灭图2GPC 洗脱曲线Fig.2GPC elute curves4.5提取溶剂的选择参

19、照国内外相关文献中NMCs 测定方法且依据相似相容原理,以试样性质、待测农药特性、提取溶剂性质3方面综合考虑,且比较单一溶剂和混合溶剂的提取效率。由于NMCs 的极性较强,且食用菌类样品水分含量较高,实验中选择了二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等中等极性偏上的有机溶剂为提取溶剂,且对单一有机溶剂和混合溶剂提取效率进行了比较,实验结果表明,使用丙酮和乙腈混合提取液的效果较优,且当提取液中丙酮与乙腈的体积比为8515时,可兼顾多种农药性质和样品基质的需要,提取效果最佳。4.6GPC 净化条件的确定按照19种NMCs 分子量大小选择了其中8种,将10mL 浓度为10g /mL 的NMCs 标准溶液吹干后,用10mL GPC 流动相(V 乙酸乙酯V 环已烷=11溶解,GPC 净化,收集不同时间段的流出液,测定其回收率,见图2。结果表明,待测农药的流出时间大部分集中在10 30min ,实验中还考察了各种空白基质样品的干扰物的流出时间,结果在10min 之前基本流出,因此,确定收集时间为10 30min ,此时可在最大程度地除去基质干扰物的同时保证农药组分的回收率符合农药残留的检测要求。4.7SPE