农杆菌介导的粳稻遗传物质转化体系的建立

1、农杆菌介导的粳稻遗传物质转化体系的建立1：研究的目的和意义籼稻是我国最大的栽培稻类型，栽培面积约占全国水稻面积的 741。籼稻离体培养的愈伤组织诱导及植株再生比较困难，且品种特异性明显，严重地影响了籼稻转基因工作的开展。筛选适于遗传转化的籼稻受体品种，建立高效、规模化的籼稻遗传转化平台，同时针对目前基因功能研究及生产上普遍应用但较难转化的籼稻基因型，有目的、有针对性的建立一套转化效率高、重复性好、简单快捷的籼稻转化体系，已成为当前籼稻转基因育种及基因功能研究的首要任务。我国地域辽阔，海岸线长，既有大量的滨海盐碱地，又有内陆盐碱地2，中国盐碱土地约为2 000 万hm2 ，其中江苏滨海滩涂地约为

2、60 多万hm2，其中只有少部分改良利用，绝大部分仍未脱盐及不断遭受盐渍危害。在影响农作物产量的各种因素中，干旱和盐碱所造成的减产达40%3。HALI基因是酿酒酵母中的重要耐盐因子，其表达参与调节细胞内离子浓度，尽管HALI基因本身不是转运蛋白，但在盐胁迫下能与ENAI基因协同作用促进Na+外排，与其它转运系统协同作用增加K+的吸收，保持细胞内低的Na+/K+比，以减轻Na+毒害，因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力，利用HALI基因转化粳稻在提高粳稻耐盐特性上有重要的理论和实践意义4。基因工程技术的使用，一方面，可以将水稻基因中不具有的基因，如抗除草剂、抗病虫、耐盐碱、提高水稻品质及产量的

3、基因导入水稻中，获得单靠传统育种方法无法实现的遗传重组，丰富水稻种质资源，提高育种效率5。另一方面，可以同时采用传统育种方法，如回交、转育等方法，来充分利用已获得的转基因材料，将目的基因导入难以转化的水稻品种中。本研究通过对粳稻胚培养、花药培养的研究，建立了水稻离体再生技术体系，为粳稻遗传转化研究奠定了基础。通过对HALI基因农杆菌法转化水稻的研究，初步建立了粳稻农杆菌介导法基因转化体系，加快了现代生物技术在育种中的应用，提升了粳稻育种和研究水平。通过本研究，以期获得转HALI基因的转化植株，创造新的耐盐材料，提高粳稻的耐盐性。2:国内外研究的动态 目前，国内外学者普遍重视水稻农杆菌介导转化技

4、术，农杆菌介导的水稻遗传转化方法已达到了应用的阶段,逐步成为水稻转化的主流技术，国内外不少实验室己建立了较成熟的农杆菌介导转化体系，这一方法将进一步朝着高效规模化方向发展6。2.1：水稻转化受体的研究进展基因转化的成功在于建立良好的受体系统。作为转化受体系统应具备如下条件：（1)高效稳定的再生能力；（2)能接受外源DNA整合，具有较好的遗传稳定性；(3)具有稳定的外植体来源；（4)对选择性抗生素敏感；（5)对农杆菌侵染的敏感性。目前，用于水稻遗传转化的受体系统有以下几种：原生质体再生系统、愈伤组织载体系统、组织器官再生系统。2.2：水稻转基因方法的研究进展基因转化的方法可分为两类：一类是直接的

5、基因转化，即将裸露的DNA直接转入植物细胞或原生质体，由此获得转基因植株的方法。包括基因枪法、原生质体法、电激法、PEG法、脂质体转化法、花粉管通道法等，其中基因枪法是目前较为常用的方法。另一类是由载体介导的转化，即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，主要有农杆菌介导法和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛用于水稻转基因研究。PEG介导基因转化是利用高浓度PEG极强的亲水性，使DNA大分子沉淀，促进水稻原生质体和外缘DNA彼此靠拢聚合，因而使水稻原生质体直接摄取外缘DNA的方法。人们利用此法已获得了水稻转基因植株7。农杆菌介导的籼稻遗传转化研究始于1

6、992年，Chan 等8首次尝试以籼稻Taichung Native1的幼根为受体材料，得到转化的愈伤组织，经Southern 分析和酶活检测证明嵌合基因已经整合到愈伤组织中，但未获得再生植株。1994 年，Hiei等9采用“双超元”载体和向侵染液中添加乙酰丁香酮等改进措施建立了粳稻的高频农杆菌转化体系，带动了籼稻遗传转化技术的研究。在此基础上，相继在Pusa Basmati I、IR 系列品种、孟加拉籼稻种质及中国不同区域籼稻品种等基因型上获得成功10。随后，研究重点从基因型依赖性弱、易转化类型的籼稻品种11转向基因型依赖性强、顽拗型籼稻品种转化体系的建立和优化。Hiei 和Komari12

7、将侵染后由一个幼胚来源的愈伤组织分割成多个独立的转化个体，大大提高了转化率，并提出了一套适合纯籼型IR24、IR64、IR72 的转化程序。之后，他们又根据同工酶多态性将籼稻品种分为偏籼型，籼型，和纯籼型，提出基于成熟胚和幼胚为起始材料的适宜不同籼稻类型的一套转化技术流程13，但是，利用这套流程成功的报道并不多。2.3：抗盐基因工程研究与进展随着现代生物技术尤其是转基因技术的发展，耐盐转基因研究取得了很大的发展。转基因技术能够打破物种间生殖隔离，创造新的资源，加快育种进程，为植物育种提供了新的思路和方法，受到研究者们的特别青睐4。盐胁迫可以诱导许多植物基因的表达14，根据这些基因产物的作用，可

8、以分为两大类15。一类基因的产物为效应分子，包括:渗透保护剂(如甜菜碱、甘露醇、海藻糖及脯氨酸等)的合成酶;维持离子平衡的蛋白质(如Na+倪十反向转运蛋白等);参与氧化胁迫保护、清除活性氧的酶(如超氧化物歧化酶、谷肤甘肤过氧化物酶、谷肤甘肤还原酶和促分裂原活化蛋白激酶等);直接保护细胞免受盐胁迫伤害的功能蛋白(如胚胎发生晚期丰富蛋白、伴侣蛋白和水通道蛋白等)。另一类基因的产物为调控分子，包括调控基因表达的转录因子，如DREB转录因了、MYB转录因了、MYC转录因了及bzIP转录因子等，以及感受和传导胁迫信号的505途径、钙神经元(CaN)途径、蛋白激酶等。2.4：关于HAL1基因HALI基因最

9、早是从酿酒酵母中克隆获得的与耐盐相关的基因。克隆后序列分析表明:其开放读码框全长879bp，编码一个294个氨基酸的多肽。HAL1基因是通过调节阳离子转移系统而使得植物获得耐盐性的，过量表达该基因的酵母转化后可耐高达150mo/L的NaCI胁迫，而剔除该基因则大大降低酵母的耐盐性; HALI基因提高酵母的耐盐性是增加细胞内K+含量，降低细胞内Na+含量，从而调节酵母细胞的K+/Na+比率16。我国学者将酵母的HALI基因转入拟南芥中，比较转基因植株和野生型植株表型无区别，测定K+、Na+浓度发现转基因植株在盐胁迫下含有更少的Na+17。张荃18等通过农杆菌介导，获得HALI基因转化番茄，可使转

10、基因植株的耐盐性提高。Ruslss等的实验也证实了转化HALI基因可以减轻高盐对番茄的危害。李淑娟189等研究表明，转基因烟草在生根培养基中的耐盐能力最高达到 1.5%NaCI，而对照植株在生根培养基中的耐盐能力仅为0.8%NaCI，转基因烟草的耐盐性有了明显提高。2.5：存在的问题2.5.1：大部分水稻转基因研究处于探索阶段虽然国内外转基因植物的研究与产业化已取得突破性进展，但是由于受到技术发展的限制，目前植物基因产品应用范围还不是很宽阔。缺乏基因的高效发掘技术，实用分子标记较少19。许多重要目标性状基因尚需紧密标记，还缺乏品质、产量、抗性等协调改良的高效育种技术。加快植物基因工程与植物细胞

11、工程的整合，并进一步完善技术体系，是我们面临的新的挑战20。不但可利用的基因较少，大部分研究处于研究探索性阶段，而且可直接利用生产的品种很少，抗逆、品质改良、生长发育、提高产量等基因工程还有待基础研究的新突破。2.5.2：转基因水稻安全性的问题转基因水稻具有极大的发展前景，将可能为我国的粮食安全保障提供新的机遇。但是，其商品化、产业化的关键在于生物安全评估，即其安全性成为公众关心的焦点。可能存在的不安全性风险主要有转基因漂移、抗虫转基因作物对非靶标生物的伤害及对土壤生物群落的影响、转基因自身杂草化和转基因作物是否有害于消费者的健康等21。如何防止转基因作物带来的潜在风险已成为转基因研究的重要课

12、题，当前提高转基因作物生物安全性的主要策略有:标记基因的有效去除、外源基因的组织特异性表达和诱导性表达、转基因漂移的防止、各种对人类低毒而对害虫高毒性抗虫基因的开发等22。3：主要研究内容：3.1：筛选剂Kan和Cb的浓度:对水稻的抗性愈伤的影响。3.2：农杆菌不同培养方式对水稻转化效率的影响。3.3：农杆菌的不同浓度对转化效率的影响。3.4：农杆菌的侵染方法对转化效率的影响。3.5：共培养天数对水稻愈伤组织遗传转化的影响。3.6：脱菌后的干燥处理对水稻愈伤组织遗传转化的影响。4：材料和方法：材料：以水稻成熟胚诱导的愈伤组织作为农杆菌介导的受体材料。试供材料为西南科技大学植物分子育种实验室提供

13、的具有良好的培养效果的材料。质粒和菌株：向相关的公司购买携带HALI基因的植物表达载体质粒为PROKll,选择标记基因为新霉素磷酸转移酶(NPTll)基因和含目的基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404/HALI，向相关的引物设计公司购买引物，比如引物系列为：5引物： 5-GGTCTAGAATGGATTTCAAAGATTTAGGATTGCATG-3； BamH13引物: 5-CGGGATCCTTTTTCAACTATTCTGTGTTGATTG-3 KpnI培养基：成熟胚愈伤组织诱导培养基N6+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+ 蔗糖30g/L+脯氨酸2.8g

14、/L+琼脂粉 6g/L pH=5.8预培养基:l/2N6max+l/2N6min+2,4-D 2mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L(pH5.8); 高压灭菌后,加入100mmol/L乙酞丁香酮.共培养基:1/2N6max+l/2N6min+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+琼脂粉6g/L(pH=5.2);高压灭菌后,加入100mmol/L乙酞丁香酮.第一次筛选培养基：N6十2,4-D 1mg/L+水解酪蛋白0.5/L+脯氨酸2.8g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L(pH5.8);高压灭菌

15、后,加入Kan 150mg/L+Cb 300mg/L+Cef 300mg/L;第二次筛选培养基:N6+2,4-D lmg/L+水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸2.8g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L+(pH5.8);高压灭菌后,加入Kan 250mg/L+ Cb 300mg/L+Cef 300mg/L;分化培养基:Ms+KT2.0mg/L+NAA lmg/L+IAA 0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L(pH5.8):生根培养基:l/2MSmax+l/2MSmin+蔗糖20g/L+多效唑4mg/L+琼脂粉6g/L(pH5.8)：LB固体培养基:蛋白胨10g/

16、L+酵母提取物5g/L+NaCI 10g/L+琼脂粉15g/L(PH7.0);LB液体培养基: 蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCI 10g/L(pH7.0);5：农杆菌介导法HALI转化粳稻受体体系的建立5.1：筛选剂Kan和Cb的敏感性实验(1):水稻愈伤组织筛选过程中Kan筛选浓度的确定取继代1次,结构致密，颗粒状愈伤组织,预培养3d后,接种于转入含Kan分别为0、50、100、150、250、300、400mg/L的筛选培养基上,25条件下暗培养,30d后观察并统计愈伤组织成活及生长情况,从而确定Kan的筛选浓度。表1：Kan的筛选浓度统计表Kan浓度mg/L愈伤接种数愈伤组

17、织成活数愈伤组织成活率/%010050100100100150100250100300100400100(2) . Cb对水稻愈伤组织的敏感性试验取继代1次的结构致密、颗粒状愈伤组织,预培养3d后,接种于转入含Cb分别为0、200、400、600、800、1000mg/L的筛选培养基上,25条件下暗培养,30d后观察并统计愈伤组织成活及生长情况,研究Cb对愈伤组织生长的影响。表2：Cb对水稻愈伤组织的敏感性试验统计表Cb的浓度mg/L接种愈伤数愈伤组织成活数愈伤组织成活率/%010020010040010060010080010010001005.2：农杆菌不同培养方式和不同的浓度对水稻转化效

18、率的影响农杆菌活化是农杆菌侵染外植体，实现遗传转化的关键。无论是 MS培养基，LB 固体培养基和液体培养液还是 YEB 固体培养基和液体培养液：培养农杆菌对转化效率应该有不同的影响。可能是由于这四种培养条件都可以满足农杆菌营养需要使农杆菌处于良好的生长状态，此外，农杆菌的浓度和侵染方法也可能对转化效率有很大的影响。表3：农杆菌不同培养方式对水稻转化效率的影响品种农杆菌培养方式抗性愈伤组织形态抗性愈伤率/%品种1 品种2表4：农杆菌的不同浓度对转化效率的影响品种农杆菌浓度抗性愈伤组织形态抗性愈伤率/%品种10.30.61.0品种20.30.61.0表5：农杆菌的侵染方法对转化效率的影响品种侵染方

19、法抗性愈伤组织形态抗性愈伤率/%品种1静置 30 min静置10 min 后振荡20 min摇床上振荡 30 min静置20 min 后负压处理 10 min品种2静置 30 min静置10 min 后振荡20 min摇床上振荡 30 min静置20 min 后负压处理 10 min6：HALI基因转化粳稻6.1：受体材料预处理取继代1次, 结构致密、色泽鲜亮的淡黄色颗粒状愈伤组织, 预培养基中培养5d 后作为带有目的基因农杆菌侵染的受体。6.2：供体菌株的培养 从含有目的基因Prokll/HALI的根癌农杆菌工程菌株LBA44O4储液(25%甘油,:70e保存)中蘸取少量菌液，于LB固体培养

20、基(含Rif50mg/L、Kan75mg/L)上划线培养,28暗培养至长出直径约lmm大小的单菌落(约48h)。 从平板上挑取单菌落接种于40mL附加75mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体培养基中, 28, 220rppm恒温摇床上振荡培养至OD600约为0.6-0.8(约36h)。 以1%-2%的比例将摇好的菌液转接于40ml新鲜且无抗生素的LB液体培养基中，28，220rppm恒温摇床上继续振荡培养至OD600约为0.6-0.8时即可。6.3：侵染在超净工作台上，经预培养的愈伤组织转入无菌烧杯中，倒入已培养好的农杆菌液，并不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，浸泡时间为25mi

21、n；将愈伤组织取出后，用无菌滤纸吸干。6.4：共培养经无菌滤纸吸干后的愈伤组织接入覆盖有一层无菌滤纸的共培养基中,于22暗培养"共培养时间分别为1,2,3,4,5d。共培养天数对水稻愈伤组织遗传转化的影响共培养天数接种愈伤数污染数污染率/%获得抗性愈伤数抗性愈伤获得率/%123456.5：脱菌处理共培养结束后,需及时有效地杀死外植体表面和深层潜伏的农杆菌，否则农杆菌的过度繁殖将会抑制或杀死愈伤组织，不能筛选出抗性愈伤组织。步骤为灭菌蒸馏水冲洗4-5次后，0.1%的升汞中灭菌2min,无菌蒸馏水冲洗2次，无菌蒸馏水浸泡30min后，再用无菌蒸馏水冲洗2次。6.6：干燥处理经脱菌处理的愈

22、伤组织，设在超净工作台上吹干至愈伤组织略有皱缩(吹干2h左右)和直接接种于筛选培养基中，观察干燥处理对转化愈伤组织培养的影响。脱菌后的干燥处理对水稻愈伤组织遗传转化的影响7：转化植株的获得与筛选转化后的愈伤组织接种于含Kan l50mg/L、Cb300mg/L、Cef300mg/L的筛选培养基中,25暗培养30d左右,转入含Kan250mg/L、Cb300mg/L、Cef300mg/L的筛选培养基中继续培养30d左右。经过筛选后的抗性愈伤组织转入分化培养基中，于25，3000lx光照培养，待分化的绿苗长至4-5cm高时，转入壮苗培养基中，进行生根培养，获取完整的Kan抗性植株。8：技术路线查文

23、献，筛选资源，确定材料质粒和菌株目的基因培养基的设置成熟胚愈伤组织诱导培养基预培养基 共培养基:第一次筛选培养基第二次筛选培养基:分化培养基:生根培养基: 引物设计HAL1体系的建立Kan浓度筛选Cb对愈伤的敏感性培养方式对转化的影响农杆菌浓度对转化的影响侵染方法对转化的影响HAL1基因的转化受体材料预处理供体菌株的培养 侵染 共培养 脱菌处理 干燥处理共培养天数对水稻愈伤组织遗传转化脱菌后的干燥处理对水稻愈伤组织遗传转化转化植株的获得与筛选参考文献；1. 万建民.中国水稻遗传育种与品种系谱（1986-2005）M.北京:中国农业出版社, 2010.2. 李继开, 水稻抗盐育种前途光明J,盐碱

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