IFN-γ上调的单核细胞表面MHC-I类链相关分子促进NK细胞活化

1、IFN-上调的单核细胞表面MHC-I类链相关分子促进NK细胞活化         11-01-31 16:12:00     编辑：studa20              作者：王惠明, 王沂芹, 阮志华, 傅晓岚, 徐文岳, 赵婷婷, 吴玉章【摘要】  目的: 研究IFN-诱导上调表达的单核细胞MHC-I类链相关分子(MICs)分子对

2、NK细胞的活化作用。方法: 采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）, 以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞及NK细胞, 以细胞因子IFN-、 TNF-刺激单核细胞后, 再将单核细胞与NK细胞共培养, 以流式细胞术（FCM）检测NK细胞表面CD69分子及胞内IFN-表达, 以51Cr释放试验检测NK细胞对K562细胞的杀伤效应。结果: IFN-上调人单核细胞表面MICs表达; IFN-刺激的单核细胞能促进异体NK细胞CD69及胞内IFN-表达, 能增强NK细胞对K562细胞的杀伤效应; 单核细胞的这种效应至少部分依赖于IFN-上调的MICs分子, 因为用抗MIC抗体封闭或用细

3、胞小室阻断细胞接触, 可以明显地抑制NK细胞的活化。结论: IFN-上调人单核细胞表面MICs分子介导了NK细胞的活化。 【关键词】  单核细胞 IFN- MHC-I类相关分子 NK细胞活化的淋巴细胞（含NK、 T、 NKT细胞）分泌的细胞因子干扰素（IFN-）不仅具有直接的抗病毒作用, 更具有强大的免疫调节和修饰功能。目前认为, IFN-能广泛地作用于体内包括淋巴细胞在内的多种细胞。对于单核细胞, IFN-一方面可以影响其向DC或巨噬细胞分化; 另一方面, IFN-还能诱导单核细胞产生系列细胞因子1, 2。机体单核细胞正常情况下处于免疫静息状态, 但在适宜的条件下, 它可以通过转化

4、为DC或者分泌大量细胞因子来参与或调节免疫应答。最近研究发现, 单核细胞与NK细胞或T细胞之间存在着对话机制, 并且IFN-及细胞间的直接接触是介导单核细胞与淋巴细胞相互作用的关键因素3。NKG2D是同时表达于人类NK细胞及CD8+T细胞表面的活化受体。对于NK细胞, 它直接启动活化信号; 对于CD8+T细胞, 它提供重要的共刺激信号4。MHC-I类链相关分子(MIC)是最早发现并且研究最多的NKG2D受体的配体。MIC是一种应激诱导表达的分子, 当细胞处于热休克、 氧化、 感染等状态时, MIC分子即被诱导表达于细胞表面。细胞表面的MICs作为一种应激“标记”分子, 能够被NK细胞或CD8+

5、T细胞表面的NKG2D受体识别, 并刺激或共刺激NK细胞或CD8+T细胞活化, 最终清除异常细胞。研究发现, MICs分子低水平的表达于某些正常组织细胞如肠上皮细胞、 内皮细胞、  成纤维细胞表面, 单核细胞表面未见MICs表达5。NKG2D还在NK细胞、 T细胞、 DC及其他组织细胞中起着重要的“桥梁”作用6。但NKG2D是否也在单核细胞与NK细胞对话中发挥作用？ IFN-作用的单核细胞是否通过MIC-NKG2D促进NK细胞活化？ 我们对此进行了探讨。1  材料和方法1.1  材料  FITC标记抗人CD3（OKT3）、 CD14（61D3）、 CD6

6、9（FN50）、 IFN-（4S.B3）单克隆抗体（mAb）、 纯化及生物素化抗人NKG2D (1D11) mAb、 PE标记抗人CD56 mAb(NCAM)、 抗体的各同型对照抗体均购于eBioscience公司; 小鼠抗人MICs mAb(clone 159207)购于R&D公司; FITC标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG二抗购自北京中山生物技术有限公司。小鼠抗人CD14免疫磁珠（CD14 Magnetic Particles, Clone MP9）、 磁性细胞分离架购于BD Bioscience Pharmingen公司; 人重组干扰素-（IFN-）、 重组干扰素-（IFN

7、-）购自PeProtech公司; 人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）购自天津TDB生物技术发展中心; 胎牛血清购自HyClone公司; FACSCalibur流式细胞仪购于BD公司。1.2  方法1.2.1  人PBMCs的分离及单核细胞、 NK细胞的分选  健康志愿者外周血用生理盐水作等倍稀释后, 按标准密度梯度离心法分离PBMCs。单核细胞及NK细胞采取阴性分选和阳性分选相结合的序贯分离法, 按说明书操作进行。先从PBMCs中分选CD14+细胞, 再从其CD14-组分中去除CD3+细胞, 最后从CD3-CD14-组分中分选CD56+细胞, 即为C

8、D3-CD56+ NK细胞。取少量细胞分别行CD14、 CD3/CD56流式细胞术（FCM）检测, 确定CD14+及CD3+CD56-细胞的纯度（>90%）。1.2.2  细胞株培养  人红白血病细胞K562由本研究所保存, 培养于含100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液中。1.2.3  单核细胞/NK细胞共培养  纯化的单核细胞按2.5×108个/L接种于24孔培养板中, 根据实验需要加或不加50  mg/L TNF-或1000 mg/L IFN-, 培养24 h后, 用无血清RPMI1640液洗细胞2次, 再以

9、含100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液悬浮并按2×108个/0.5 L/孔接种细胞于48孔板内; 纯化的异体NK细胞用RPMI1640完全培养液悬浮并调整细胞密度为4×108个/L, 按每孔0.5 mL接种于单核细胞培养板内, 使总体积为1 mL。如果要阻断NK细胞与单核细胞的直接接触, 可先在单核细胞培养板内放入细胞小室, 再将NK细胞加于小室中; 如要作抗体阻断试验, 可在共培养体系中加入抗MICs mAb 159207或抗NKG2D阻断抗体。继续培养24 h。1.2.4  NK细胞表面CD69及胞内IFN-表达分析  收集共培养细胞

10、, 用流式洗液洗细胞2次后, 将各组细胞等分成相应管数, 每管细胞悬液体积约50 L。采用PE-CD56/FITC-CD69或PE-CD56/FITC-IFN-双色流式检测。简述如下: 如检测NK细胞CD69表达, 在细胞悬液中加入PE-CD56/FITC-CD69单克隆抗体或其同型对照抗体, 4避光孵育20 min, 流式洗液洗细胞1次, 再以10 g/L多聚甲醛悬浮细胞即可上机检测; 如作NK细胞胞内IFN-染色, 先在细胞悬液中加入PE-CD56 mAb或其同型对照抗体, 4避光孵育20     min, 流式洗液洗细胞1次, 再以细胞固定液固定细

11、胞10 min, 用细胞通透液洗细胞2次后, 用50 L流式洗液悬浮细胞, 加入FITC-IFN- mAb或其同型对照抗体, 4避光孵育20 min, 细胞通透液洗细胞1次后, 再以10 g/L多聚甲醛悬浮细胞上机检测。1.2.5  NK细胞51Cr释放试验  K562的标记: 以100 Ci Na2（51CrO4）（中国同位素公司）标记1 mL细胞数为5×106个的靶细胞, 37孵育90 min, 再以RPMI1640液洗细胞3次。按不同效靶比（ET）值, 将标记好的K562细胞加入至NK/单核细胞共培养体系中, 并使终体积数为200 L, 天然释放孔不含效应细

12、胞, 最大释放孔加入100 L 20 g/L Triton X-100,   每孔设复孔数为3。50 mL/L CO2、 37条件下孵育4 h。离心后吸取每孔上清, 用FT-603型闪烁计数仪测定每份上清的cpm值。特异性溶细胞活性由特异性释放百分数表示, 按下述公式计算: 特异性释放率=（实验孔cpm自然释放对照孔cpm）/（最大释放对照孔cpm自然释放对照孔cpm）×100%。2  结果2.1  细胞因子IFN-对人单核细胞MICs表达的上调作用  活化淋巴细胞分泌的细胞因子TNF-与IFN-一样也参与了淋巴细胞与其他细胞如DC的

13、相互作用7。TNF-与IFN-对单核细胞MICs表达的影响尚不清楚。在此一并研究了TNF-及IFN-对纯化的人单核细胞表面MICs表达的作用。新鲜分离的人单核细胞表面低水平或阴性表达MICs分子, 经IFN-刺激24 h后, 单核细胞表面MICs分子明显上调。细胞因子TNF-不能轻微上调单核细胞表面MICs表达（图1）。2.2  IFN-刺激的单核细胞对NK细胞的活化作用  进一步研究IFN-及TNF-刺激后的单核细胞活化NK细胞的能力。结果显示, 无论是新鲜分离还是在体外培养24 h后的单核细胞, 都不能促进NK细胞表面CD69及胞内IFN-表达, 也不能促进NK细胞杀伤

14、NK敏感的K562细胞; TNF-作用后的单核细胞能微弱的促进NK细胞CD69及胞内IFN-表达,对NK细胞的细胞毒作用亦有一定增强作用; 当单核细胞与IFN-共培养24 h后, 单核细胞对NK细胞有很强的活化作用, 表现为NK细胞表面CD69及胞内IFN-表达、 NK细胞对K562的杀伤活性均明显增强（图2）。图1  细胞因子TNF-与IFN-对人单核细胞MICs分子表达的影响（略）图2  IFN-刺激后的单核细胞促进NK细胞活化（略）A: IFN-刺激后的单核细胞与异体NK细胞共培养后, NK细胞CD69及胞内IFN-表达明显增强, 而TNF-刺激后的单核细胞无此效应;

15、 B: IFN-而非TNF-刺激后的单核细胞与NK细胞共培养后, NK细胞对K562的杀伤活性明显增强.2.3  MICs及细胞直接接触在单核细胞活化NK细胞中的作用  IFN-能诱导单核细胞MIC上调表达, IFN-作用后的单核细胞能活化NK细胞, 单核细胞表面MIC分子在NK细胞活化中的作用如何？ 对此进行了研究。首先进行MIC抗体阻断试验: 1000 mg/L IFN-刺激单核细胞24 h后, 在NK细胞/单核细胞共培养体系内加入饱和剂量(5 mg/L)的抗MICs mAb 159207, 或者加入相等剂量的的同型抗体, 结果显示, 加入同型对照抗体后, NK细胞表面CD69及胞内IFN-表达明显升高（图3A）, NK细胞对K562的杀伤活性也明显增强（图3C）; 但加入饱和剂量的抗体159207后, NK细胞表面CD69及胞内IFN-表达、 以及NK细胞对K562的杀伤活性大幅下降（图3A、 C）, 较静息的NK细胞