鲎试剂用于细菌内毒素检测碳酸氢钠注射液的研究

1、    鲎试剂用于细菌内毒素检测碳酸氢钠注射液的研究        摘要目的：通过试验以确定碳酸氢钠注射液可用细菌内毒素代替传统的热原检查法。方法：用鲎试剂和家兔做对照试验确定灵敏度。结果：用灵敏度为0.125 EU.ml1的鲎试剂进行内毒素检查比家兔灵敏度高12倍。结论：细菌内毒素检查法可以代替热原检查法。关键词碳酸氢钠注射液；抑制/增强试验；细菌内毒素试验；热原试验Study on BET in sodium bicarbonate injection with TALZ

2、hao Xiaomeng(Zhao XM)， Yang Jiejiao (Yang JJ)， Zhu Yongquan(Zhu YQ)(The Quality-inspection Section of the Pharmaceutical Department in Shenzhen Peoples hospital Shenzhen 518019)ABSTRACTOBJECTIVE:To determine whether bacterial endotoxins test(BET) can replace the pyrogen test for the sodium bicarbona

3、te injection.METHODS:The comparative experiment of tachypleus amebocyte lysate(TAL) and rabbits were studied to determine the sensitivity.RESULTS:The sensitivity of TAL test was 0.125 EU.ml1, 12 times higher than that of using rabbits.CONCLUSIONS:BET may replace pyrogen test.KEYWORDSsodium bicarbona

4、te injection, inhibition/strengthen test, bacterial endotoxins test, pyrogen test碳酸氢钠注射液中国药典1995年版二部、中国医院制剂规范第2版均一直沿用家兔法进行热原检查。针对医院制剂快速检验的特点，开展热原检查法有一定困难。我们根据鲎试剂用于药品中细菌内毒素的检测具有灵敏、快速、实用性强等优点，用细菌内毒素检测法对碳酸氢钠注射液中的细菌内毒素进行了检测，并发现按细菌内毒素理论限值计算，此试验浓度进行细菌内毒素检查时存在假阴性反应。针对这一问题我们对碳酸氢钠注射液能否用于细菌内毒素检查法进行了考察，现介绍如下。1

5、实验材料和用具鲎试剂(批号970702，标示灵敏度0.125 EU.ml-1，厦门鲎试剂厂)，细菌内毒素国家标准品(批号962，每支为7200 EU，中国药品生物制品检定所)，鲎试剂溶解水(BET，批号970624，每支为2 ml，厦门鲎试剂厂)，碳酸氢钠注射液(批号970512，970612，970704，深圳市人民医院制剂中心)，ZH2旋涡混合器(天津药典仪器厂)，试验用家兔(新西兰种，广州试验动物场)，所用试验用具均经除热原处理。2实验方法与结果2.1供试品细菌内毒素的理论限值计算按中国药典1995年版，本品热原注射剂量M=10 ml.kg-1，静脉给药时临床无任何不良反应，细菌内毒素阈

6、剂量K=5 EU.kg-1，理论限值为L=K/M=0.5 EU.ml-1。2.2鲎试剂灵敏度复核和样品对鲎试剂抑制/增强试验2.2.1鲎试剂灵敏度复核按中国药典1995年版二部方法进行。鲎试剂：批号970702，b=0.125 EU.ml-1。2.2.2样品对鲎试剂抑制/增强试验取溶解好的细菌内毒素国家标准品，用碳酸氢钠注射液制成含内毒素0.5，0.25，0.125，0.0625 EU.ml-1 4个浓度。每一步均在漩涡混合器上混合30 s，将鲎试剂20管排列成5列，其中4列分别加入供试品阳性对照0.1 ml，另一列为阴性对照与鲎试剂混合，于37水浴中60 min观察。结果表明供试品在0.5，

7、0.25，0.125，0.0625，0.03125 EU.ml-1浓度下存在抑制作用，见表1。表1鲎试剂和供试品抑制/干扰试验试管号内毒素浓度/EU.ml-1反应终点浓度c/EU.ml-1鲎敏1+-试度2+-剂试3+-灵验4+-供扰1-试试2-品验3-干4-2.3碳酸氢钠注射液的最高非抑制浓度实验 取碳酸氢钠注射液样品，稀释成14，16，18，110，112的浓度，混合均匀取0.1 ml加入到含有0.5，0.25，0.125，0.0625 EU.ml-1细菌内毒素的鲎试剂中，37水浴1 h观察，结果见表2。经实验结果表明，碳酸氢钠注射液浓度在16或以上时，对鲎试剂有抑制作用；在18以下时，没有

8、抑制作用；故碳酸氢钠注射液最高非抑制浓度为18，试验浓度为110。试验结果见表2。表2供试品的最高非抑制浓度试验鲎试剂样品批号稀释倍数反应终点浓度c/EU.ml-1对照溶解水970512原液12EU/ml14批号97061216970704189707021101122.4碳酸氢钠注射液试验浓度的干扰试验 选取3批样品进行干扰试验，用110的供试品将每支为10 EU细菌内毒素工作标准品制成0.5，0.25，0.125，0.0625 EU.ml-1 4个浓度，测试110试验浓度下对鲎试验的干扰情况。其结果表明，3批碳酸氢钠注射液样品对鲎试验均未出现抑制或增强。2.5家兔法和鲎试验法比较2.5.1

9、用鲎试剂溶解水，将国家标准品962，每支为7200 EU稀释成适当浓度，加至碳酸氢钠注射液中，使之制成含内毒素1.0，1.2，1.5 EU.ml-1的溶液，分别按热原检查法和细菌内毒素检查法对各种浓度的内毒素溶液进行检查。试验结果表明，样品内含1.0，1.2 EU.ml-1的内毒素均未引起家兔反应，内毒素标准品在剂量为1.5 EU.ml-1时可致家兔明显发热反应，而这3种浓度下的鲎试验法均为阳性反应。结果见表3。通过试验表明，细菌内毒素法在内毒素浓度为0.125 EU*ml-1时鲎试剂已凝集，按两种方法产生实验反应时内毒素浓度之比1.5/0.125=12，即确定内毒素法灵敏度是热原法的12倍。

10、表3热原法和细菌内毒素法的比较内毒素浓度/EU*ml-1体重kg第一次测温第二次测温平均体温注射后第一次测温注射后第二次测温注射后第三次测温最高温度温差加入内毒素浓度(EU.ml-1)样品浓度(110)注：按家兔10 ml/kg剂量注射。实验时室温为26，室内无任何干扰3讨论3.1碳酸氢钠注射液的PH为7.58.5左右。将原液或12溶液加入鲎试剂中后，出现白色混浊。通过抑制试验表明，对鲎试剂的凝集反应产生强烈干扰，出现假阴性；在浓度18时，则无干扰。3.2碳酸氢钠注射液按最大有效稀释倍数D=L/计算应稀释4倍，但经最高非抑制浓度试验表明，在此浓度下仍有干扰，故加大稀释倍数。通过抑制/增强试验表明，将碳酸氢钠注射液样