生物表面活性剂排油圈检测方法的改进和应用

1、黑龙江八一农垦大学学报第21卷生物表面活性剂是微生物在生长过程中产生的具有表面活性的两性化合物1,由一个或多个亲水性和疏水性基团组成,亲水基是羟基、磷酸盐或糖基,疏水基是蛋白质或脂肪酸链等2。生物表面活性剂具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡功能,还有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能被生物降解等性能3。生物表面活性剂在生物修复、医药、洗涤业、农业、原油开采、采矿及食品工业等方面都有很好的应用潜力4。生物表面活性剂的检测方法在分离筛选产生物表面活性剂微生物的过程中占有重要的地位4。目前,生物表面活性剂的检测方法主要有血平板法、液滴坍塌法和排油圈法5。血平板法的缺点是血平板制作不好,则不易发

2、现溶血圈,从而直接影响到试验结果6。在微生物菌株的初筛过程中,其表面活性剂的产量往往比较低。液滴坍塌法虽然精确度较高,但该方法操作繁琐,且不适宜检测低剂量表面活性剂7,8。排油圈法操作简单、结果准确,并可检测低剂量表面活性剂9,因此被广泛应用于生物表面活性剂产生菌的筛选研究中。目前,排油圈法常使用正十六烷烃、橄榄油、机用柴油和液体石蜡等试剂。由于油相与水相都是无色透明的液体,两者之间没有颜色差别,无法进行实时拍照记录,只能根据光的折射靠肉眼来判断和测量排油圈的大小。因此,试验结果照片需划辅助线标记排油圈10,从而直接影响到试验结果的真实性和可信度。本研究对生物表面活性剂排油圈检测方法进行改进,

3、采用改进后方法进行的排油试验,结果更加生物表面活性剂排油圈检测方法的改进和应用毕思宁1,王彦杰2,左豫虎1摘要:本研究对生物表面活性剂排油圈检测方法进行改进,将原方法中所用液体石蜡加入苏丹红染色,改进后方法的测定结果与原方法结果相比差异不显著,并且试验效果对比明显,容易观察,可以实时拍照。方法操作简单、测定结果准确,很有实际应用价值。Improvement and Application of Oil Spreading to Detect BiosurfactantBi Sining 1,Wang Yanjie 2,Zuo Yuhu 1(1.College of Agriculture ,H

4、eilongjiang Bayi Agricultural University ,Daqing 163319;2.College of Life Science and Technology ,Heilongjiang Bayi Agricultural University Abstract :The liquid paraffin stained by Sudan red was used to improve the oil spreading in this study.The results by the improved method are same as that by th

5、e original one ,but the degreasing effects of fermentation broth to liquid paraffin were easily to be observed ,and could also be photographed ,for there were significant color differences between the water phase and the red oil phase.The method is of importance in application for its simplicity.The

6、 degreasing activity of BS1fermentation broth was studied ,and the results showed that diameters of oil spreading were increased as the concentrations of fermentation broth increased.Key words :biosurfactant ;detection ;oil spreading收稿日期:2009-11-06基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(200802230001,黑龙江省教育厅项目(1055

7、1231。作者简介:毕思远(1983-,男,黑龙江八一农垦大学2007级在读硕士研究生。通讯作者:左豫虎,教授,博士研究生导师,E-mail :zuoyhu 。文献标识码:A第21卷第6期2009年12月黑龙江八一农垦大学学报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University 21(6:5860Dec.2009文章编号:1002-2090(200906-0058-03第6期直观、容易观察和判断。1材料与方法产生物表面活性剂菌株BS1分离自大庆油田石油污染土样,由黑龙江八一农垦大学植物免疫研究室分离鉴定并保存。将供试菌株的16S rDNA序列

8、(菌株在GenBank的登录号为GQ281048与GenBank中的已有序列对比,结合生理生化试验及菌体和菌落形态学上的对比表明供试菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.。液体石蜡(A.R,北京化工厂,苏丹红(上海试剂三厂。参照李宝明等11的配方略有改动。NaNO31.5g、(NH42SO41.5g、K2HPO4·3H2O1.31g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、CaCO30.002g、蒸馏水1000mL、液体石蜡5%,pH7.0。将保存于4冰箱中的菌株,在牛肉膏蛋白胨斜面上活化培养24h,然后用无菌水

9、配制成菌悬液(107cfu,以5%的接种量接种于150mL发酵培养基中,于170r·min-1、30条件下振荡培养4d,即得发酵液。发酵液无气味、呈乳白色、较浑浊(以空白发酵液为对照,OD640为1.61.8,pH5.0。参照杨乐等12的方法推断供试菌株产生的表面活性剂为糖脂类表面活性剂,其分子的具体结构有待于进一步研究。将0.5g苏丹红溶于100mL液体石蜡,搅拌均匀后,过滤除去杂质。发酵液的排油活性测定将8mL未染色和经苏丹红染色后的液体石蜡分别加入装有60mL蒸馏水的直径为9cm的培养皿中,待整个平板形成一层分散均匀的薄膜后,用微量移液器在油膜中心慢慢加入1mL浓度分别为10%

10、、30%、50%、70%、90%、100%的发酵液,测量排油圈直径并照相,以在油膜中心加入1mL相应浓度的空白发酵培养液处理作对照,每处理三次重复。2结果与分析用未染色液体石蜡对发酵原液(浓度100%进行生物表面活性剂排油活性检测,油相与水相间色差对比度小,实时拍摄照片中无法观察到排油圈(图1-1。将液体石蜡加入苏丹红染色后,使油相和水相之间形成了较好的色差,实时拍摄照片中可以清晰地观察到排油圈,而且不同浓度发酵液的排油效果呈现规律性变化,随着发酵液浓度的增加,排油圈直径增大(图1-2,3,4,6,7,8。说明发酵液中表面活性剂的含量和活性与发酵液的浓度呈正相关。对照处理未出现排油圈(图1-5

11、。1.未染色液体石蜡;2-8.染色后液体石蜡;2.10%发酵液;3.30%发酵液;4.50%发酵液;5.空白对照;6.70%发酵液;7.90%发酵液;8.100%发酵液图1发酵液对液体石蜡的排油效果图Fig.1Degreasing effects of fermentation broth to liquid paraffin毕思宁等:生物表面活性剂排油圈检测方法的改进和应用59黑龙江八一农垦大学学报第21卷不同浓度发酵液的排油活性测定结果表明(表1,排油圈直径随着发酵液浓度增加而增大,发酵液对以上2种油相的排油圈直径在0.05水平上差异不显著。可以采用苏丹红染色后的液体石蜡代替不染色的液体石

12、蜡进行排油圈试验。注:表中数据均为三次重复平均值,采用Ducan 氏新复极差法进行差异显著性分析,同一行相同字母表示在5%水平上差异不显著。表1不同浓度发酵液的排油活性测定结果Table1Results of degreasing activity of different concentrations of fermentation broth发酵液浓度/%染色后液体石蜡处理排油圈直径/cm未染色液体石蜡处理3结论与讨论本研究利用红色有机染料苏丹红不溶于水而溶于油的特点,对生物表面活性剂排油圈检测方法进行改进,将原方法中所用液体石蜡加入苏丹红进行染色。改进后的方法解决了由于油相与水相之间无色

13、差而导致的只能单纯依靠肉眼观察试验结果、实时拍照记录中观察不到排油圈的问题。本方法操作简单、结果准确,为更好的应用排油圈法检测生物表面活性剂提供帮助,具有很好的实际应用价值。排油活性试验能间接地反映生物表面活性剂的含量和表面活性的强弱。采用本方法对不同浓度发酵液进行排油活性测定,结果表明排油圈直径随发酵液浓度的增加而增大,试验结果与牛明芬等13的研究报道相一致。参考文献:选J .微生物学学报,1999,39(3:264-267.构、功能及生物合成J .微生物学通报,2006,33(5:122-128.生表面活性剂的研究J .微生物学通报,2000,27(6:413-416.5傅时波,李尔炀.生

14、物表面活性剂检测方法的研究J .江苏工业学院学报,2007,19(2:23-25.6Mulligan C N ,Cooper D G ,Neufeld R J.Selection ofmicrobes producing biosurfactants in media without hydrocarbons J .Journal of fermentation technology ,1984,62(4:311-314.7Jain D K ,Collins-Thompson D L ,Lee H ,et al.A drop-collapsingtestforscreeningsurfactant -producingmicroorganisms J .Journal of Microbiological Methods ,1991,13(4:271-279.of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms J .Journal of Microbiological Methods ,2004,56(3:339-347.量J .化学工程师,2005,112