抗氧化酶活性等测定方法

1、叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每 L 水依次加入MES(195.2× 0.05=9.76g)、山梨糖醇 (0.33 × 182.2=60.126g)、NaCl（ 0.010× 58.5=0.585g ）、MgCl（0.002 × 95=0.19g ）、EDTA（ 292.25 × 0.002=0.5845g ）、KH2PO（4 200×0.0005=0.1g ）；使用时加入 ASA-Na（ 198.1 ×0.002=0.3962g ）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为 238.3 × 0.05=

2、11.915g的 HEPES（ 238.3 × 0.05=11.915g ）；3、 80%Percol ： 80ml 原液 +20ml 水； 40%Percol ： 40ml 原液 +60ml 水；实际配制：PBS提取液 2000ml(3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *20ml*3 次 =1080ml), 悬浮液 100ml （3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *1ml*3 次=54ml ） ;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（ 3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *3ml*3 次 =162ml）二、提取步骤1、 10g 鲜样加 2

3、0ml 提取 PBS（ 50mM MES PH6.1，含 0.33M 山梨糖醇， 10mM NaCl， 2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na， ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小， 4 层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液 2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值( 水平转头，加速度调到9) ，约经 30s 后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min 左右完成；4、沉淀用1ml 提取液漂洗表面悬浮物；5、用 1ml 悬浮液（ 5

4、0mMHEPESpH 7.6 ，含 0.33 mM山梨糖醇， 10mMNaCl，2mMMgCl2，2mMEDTA，0.5 mMKH2PO4，2mMASA-Na， ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动， 使叶绿体由于震动分散开来， 不要用棉球吸滤， 以防被膜压破。 叶绿体悬浮时要浓点，含叶绿素 2mg.ml-1 以上，这样有利于保持活性。6、 2000g 1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮 ;( 悬浮液同5，可以不做 )8、用 Percol试剂进行梯度离心（将3ml 含有 80%Percol （原液按 100%算）铺在 10ml 离

5、心管下层，再把3ml 40%Percol铺在离心管中层，然后将1ml 叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）1500g 2-3min （用水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1），下降也要缓慢下降，否则会破碎Percol 的浓度梯度层的形成， 取出会看到 3 层绿色带， 最上层为破碎的叶绿体， 沉在地层的为粗颗粒，40-80%的 Percol之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体;9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml-1 ；（计算：取叶绿体悬浮液0.1ml ，加 4.9 ml80%的丙酮， 摇匀后于 1000g 离心 2min ，上清液置于1cm的比色杯， 在

6、625nm上比色， 按照公式计算： OD625nm× 50/34.5= 叶绿素 mg/ml）10、测定叶绿体的完整性，完整率达到85-95%；参考： Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participationof hydrogen peroxidein the inactivationof Calvin-cycleSHenzymein so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.1取上述制备的完整叶绿体进行如下测定：1、 用 50mM PBS（保护酶或其他

7、测定项目的缓冲液）稀释2-5 倍，用于测定SOD、 POD、 CAT、 APX；2、 用冷丙酮稀释2 倍，取 0.5ML 提取液用于测定H2 O2 ；（本试验中用0.2 mol/L HClO4 稀释）3、 用 5%的 TCA稀释 2-5 倍，取 1.5ml 用于测定MDA；4、 用乙醇：丙酮：水=4.5 ： 4.5 ： 1 稀释，用于测定叶绿素；抗氧化酶（ SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法一、 超氧化物歧化酶（ SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（ 1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS， pH7.8) ：A 母液： 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 : 取

8、 Na HPO·12H O（分子量358.14 ） 71.7g ；242B 母液： 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01 ） 31.2g 。分别用蒸馏水定容到1000ml 。0.05mol/L PBS（ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO4) 228.75ml ， B 母液 (NaH2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至 1000ml。参考文献： 李合生主编：植物生理生化实验原理和技术. 高等教育出版社，2000：267268。（ 2） 14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7

9、.8 ）定容至 1000ml 。（ 3） 30 M EDTA-Na2 溶液：取0.001gEDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至100ml 。（ 4） 60 M核黄素溶液：取 0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（ 5） 2.25mM 氮蓝四唑 (NBT) 溶液：取 0.1840g NBT 用 PBS定容至 100ml，避光保存。（上述试剂先配好，放到4 度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在4 度冰箱中，不要在最上层，避免见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加）酶液制备： 取 0.2g （可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗

10、净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8 ）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、 12000g 下离心 20min ，上清液即为酶液。2、酶活性测定（ 1）反应混合液配制 ( 以 60 个样为准 ) ：分别取 Met 溶液 162ml，EDTA-Na2 溶液 0.6ml （加的量和前面的浓度要核对） ，磷酸缓冲液 5.4ml ，NBT溶液 6ml ，核黄素溶液 6ml, 混合后摇匀；SOD反应混合液： 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml( 实际配置200ml)（ 2）分别取 3ml 反应混合液和30 l （可视

11、情况调整，最好先做一个浓度梯度，看加多少合适，如果量太少，最好稀释后再加，这样精确）酶液于试管中（尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁打下去先加酶液，后加反应液，加好后摇一摇，看看试管上是不是有雾气，最好拿纱布把试管下边擦一下，免得雾气挡住光线照过去） ；（ 3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux 光照下反应20min；（照光很重要， 试管要选择相同规格的，2因为不同的试管透光率是不一样的，试管架不要选择遮光的，这个最好分组做，同时几组做相互之间会遮光，每一组一个重复，就是每一组中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，把根和叶分开做，最大管放在中间）同时做两支对照管，其中 1

12、支试管取 3ml 反应混合液加入 30 l PBS （不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另 1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（ 4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定) 。（ 5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1 个酶活单位（ u）。SOD总活性( Ack -A E ) × V/（1/2A ck× W× Vt ）SOD比活力 SOD总活性 / 蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW ）；比活力单位以酶单

13、位每毫克蛋白表示；Ack 为照光对照管的吸光度； AE 为样品管的吸光度；V 为样品液总体积（ml,1.6ml ，加入 PBS的体积 ) ；Vt 为测定时的酶液用量（ ml，30ul ）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g 。二、 POD、 CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、 过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）（ 1）试剂配制：0.2mol/L 磷酸缓冲液 (pH6.0) ：分别取 A母液 (Na2HPO4) 123ml 和 B母液 (NaH2PO4 ) 877ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M，pH6.0) ；（ 2）反应

14、混合液配制（以60 个样为准）：取 200ml PBS(0.2M， pH6.0) ，加入 0.076ml 液体（原液）愈创木酚（ 2- 甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入 0.112ml 30 的 H2 O2，混匀后保存于冰箱中备用。POD反应混合液： 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml( 实际配置 200ml, 0.076ml, 0.112ml)（ 3）样品测定：取 3ml 反应液并加入 30 l 酶液，以 PBS为对照调零，而后测定 OD470值（测定 40 秒）。（边加样边测定，测定前等待 5 秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始

15、记时的时间相差不大）（ 4）酶活性计算：以每min OD 值变化（升高）0.01 为 1 个酶活性单位（u）。POD=（A470×Vt ） / （ W× Vs× 0.01 × t ）(u/g min)A470：为反应时间内吸光度的变化； W为样品鲜重 (g) ； t 为反应时间 (min) ； Vt 为提取酶液总体积（ ml， (1.6ml ）； Vs 为测定时取用酶液体积（ ml， 30ul ）。2、 过氧化氢酶（CAT）活性测定（ 1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（ pH7.0 ）：取 A 母液 (Na HPO) 457.5 ml和 B 母

16、液 (NaH PO) 292.5 ml混合后2424用蒸馏水定容至1000ml。3（ 2）反应液配制：取 200ml PBS（ 0.15M，pH7.0 ），加入 0.3092ml 30% 的 H2O2（原液）摇匀即可。CAT反应液： 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml( 实际配置200 ml,0.3092ml )（ 3）样品测定： 取 3ml 反应液加入 0.1ml （可视情况调整） 酶液，以 PBS为对照调零， 测定 OD240（紫外）（测定 40s ）。（ 4）酶活性计算：以每 min OD 值减少 0.01 为 1 个酶活性单位（ u）。CAT=A

17、240× Vt /（ W× Vs× 0.01 × t ）(u/g min)A240：为反应时间内吸光度的变化； W为样品鲜重 (g) ； t 为反应时间 (min) ； Vt 为提取酶液总体积（ ml， 1.6ml ）； Vs 为测定时取用酶液体积（ ml, 0.1ml ）。三、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定（缓冲液为K）1、试剂配制（按50 个样计算）：（ 1） 0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4 缓冲液（pH7.0 ）的配制：（ A） K2HPO4· 3H2O： 228.22 × 0.05 ×0.6

18、1=6.9607g（ B） KH2PO4：136.09× 0.05 × 0.39=2.6538g ，以上两者混合起来用去离子水定容到1L。（ 2） 0.1 mM EDTA-Na2：取 0.01861g EDTA-Na 2 用 PBS 溶液定容到 500 ml （ 372.24 g/M × 0.1mM× 500ml=0.01861 g ）；（ 3） 5 mMAsA：取 0.044g 抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml（现用现配，176.13g/M5mM× 50ml=0.044g）；（ 4 ）O2：取0.2ml,30%H 2O2 用去离子水稀释到1

19、00ml （ 30% H2O2 为 550g× 30%/(34.01g/M ×20mMH0.5L)=9.703M）。实际配置0.1 mMEDTA-Na2：3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1.7ml*3次测定 =91.8ml; （实际配置250 ml,0.009305g ）5 mM的 AsA: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml,0.044g）20mM H2O2 : 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml,0.1ml）2、酶活性的测定（以2

20、 ml 体系测定）（ 1）取 0.10 ml 酶液（可视情况调整） ，加入 1.70 ml 含 0.1 mMEDTA-Na2 的 PBS（ 0.05 mol/L ，pH7.0 ），再加入 0.10 ml 5 mM的 AsA，最后加入0.10 ml 20mM H 2O2，立即在20下测定 D290（紫外）值在40s 内（测定时间内变化大可测定的时间短点，否则长点）的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，缓冲液调零） 。计算公式： OD/ t × Vr× VT A× d× Vt × W OD为反应时间内吸光度的变化（ 40 秒吸光度

21、 0 秒吸光度）； t 为反应时间（ 40 秒）； Vr 为反应-1-1液体积（ 2mL）； VT 提取液体积（ 1.6mL）； A 为消光系数（ 2.8mM .cm ）； d 为比色杯厚度（ 1cm）； Vt 测定液体积（ 0.1mL）； W为样品鲜重（ 0.2g ）。.-四、超氧阴离子自由基（O2 ）产生速率的测定（羟胺氧化法）41、试剂的配制（ 1） 1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g 盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；（ 2） 17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g 对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1： 3配制）加热溶解后定容至400ml；（ 3）7mM - 萘

22、胺溶液： 称取 0.4008g - 萘胺用冰醋酸水溶液 （冰醋酸： 水 =3：1 配制）定容至 400ml 。实际配置PBS（ 0.05M， pH7.8 ） :3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.5ml*3 次测定 =27ml; （实际配置 100 ml ）1mM盐酸羟胺溶液 : 3个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1ml*3次测定 =54ml; （实际配置 100 ml,0.00695g）17mM对氨基苯磺酸 :3个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1ml*3次测定 =54ml; （实际配置 100 ml,0.2944g）7mM - 萘胺溶液： 3 个处理 *2 个品种 *3

23、 次重复 *1ml*3 次测定 =54ml; （实际配置100 ml,0.1004g）2、O2.- 含量的测定（ 1）样品液提取方法同SOD测定；（ 2）取 0.5ml提取液（酶液） （可视情况调整用量）中加入0.5ml PBS （0.05M， pH7.8 ）， 1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。（ 3）在 25下保温1 小时；（ 4）依次先加入1ml 17mM 对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM - 萘胺，混合后快速摇匀；（ 5）在 25下保温 20min 后在 3000× g 下离心 3min 后马上进行测定（或置于冰箱待测）；（ 6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定

24、OD530值（测定）；.-含量的计算：由测得的-标准曲线得到NO- ；根据羟胺与.-的反应式： NHOH（7）OOD530，查 NOO22222.-+NO-.-.-；再根据样品与羟胺反应的时间和样品中 2O H2 H2O2 H2O 计算 O2 ，即 NO2 × 2=O2的蛋白质含量，求得.-产生速率（以 nmol min-1-1蛋白表示，也可以nmol min-1-1鲜重表示）。O2mgg.-产生速率 =（ C× V） / （ t × W）（ nmol min-1g-1鲜重）O2C 为标准曲线上查得的浓度 (umol/L)；V 为测定时所取提取液用量( 叶绿体稀释

25、后的体积) ；t 为反应时间 (60min) ； W为样品鲜重 ( 叶绿体实际质量g)参考文献： 王爱国，罗广华植物生理学通讯，1990，（ 6）： 55 57五、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（ 1）考马斯亮蓝溶液配制： 称取 100 mg考马斯亮蓝， 溶于 50 ml 90乙醇中， 加入 100 ml 85（ W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。（ 2） 100 g/ml 牛血清蛋白（ BSA）标准溶液：称取 25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml ，再从中吸取 40ml 用蒸馏水定容至 100 ml

26、（也可取 10mg BSA定容至 100ml 即为 100g/ml 标准 BSA溶液）。实际配置0.05M，pH7.8 磷酸缓冲液： 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.08ml*3 次测定 =0.3456ml; （实际配置 100 ml, ）5考马斯亮蓝溶液: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *2.9ml*3次测定 =156.6ml;（实际配置200 ml， 20mg）2、样品可溶性蛋白含量的测定（ 1）样品可溶性蛋白含量测定：取 20 l 提取液（酶液）加入 80l ，0.05M，pH7.8 磷酸缓冲液（即稀释成 0.1ml 提取液），再加入 2.9ml 考马斯亮蓝溶液，

27、反应 2min 后测 OD595（以 100l 缓冲液加 2.9ml 考马斯亮蓝为对照调零） 。（ 2）蛋白质含量计算：可溶性蛋白质含量（mg/g） =(C× VT)/(W × VS× 1000)C 为标准曲线查得的蛋白质含量 （ g）；VT 为提取液总体积 （稀释后的体积 ml ）；VS为测定时所用提取液体积（ ml， 20 l ）； W为样品鲜重（ g）。过氧化氢（ H2O2）含量的测定一、试剂配制：1、 0.2 mol/L HClO4：取10.05g HClO 4 溶解于 0.5L 的水中；2、 4 mol/L KOH ：取 112 g KOH 溶解于 0.

28、5L 的水中；3、0.1 mol/L ，pH 6.5 的磷酸缓冲液： Na2HPO4·12HO5.6407g+NaH2PO4·2HO5.3433g 用去离子水定容到500ml；4、显色液： 100mL、0.1 mol/L、 pH 6.5 的磷酸缓冲液+25 L N,N- 二甲基苯胺 +10 mg 4- 氨基氨替吡啉；5、过氧化物酶溶液（250 U/mL ）二、测定步骤：称取植株根和叶片组织各0.5g ，分别置于研钵中，加入1.6 mL 预冷至 4的 0.2 mol/L HClO4，冰浴匀浆，于10 000 ×g 离心 5 min （ 4），取上清液，加4 mol/

29、L KOH 调 pH 值为 7.5 后，再于10 000 × g 离心 5 min（ 4），取上清液 1 mL，加 0.4 mL显色液和 0.1mL 过氧化物酶溶液（ 250 U/mL），用岛津 UV-1601 分光光度计测定波长 550 nm（可见）处光密度值的变化， H2O2 含量以 mol/gFW 表示。（用什么调零？ ）三、计算方法： （要做标线？ ）参考：过氧化氢（H2 O2）含量的测定参照Uchida 等 (2002) 方法并加以改进。还原型谷胱苷肽GSH2 试剂配制（ 1） 1mM GSH标准液 10mL（现用现配）：称 3.0733mgGSH,加蒸馏水至 10mL。

30、( 不要 )（ 2） 5磺基水杨酸 500mL： 25g 溶于 500mL水中。（ 3） 6mM DTNB：称取 0.118905g DTNB 溶于 50mL PBS（ 0.1M，pH7.5 ）中。（ 4） 2mM NADPH： 18.1mg NADPH溶于 10mL PBS中。（ 5） 1mMGSSG标准液 10mL： 6.126mg GSSG加 PBS至 10mL。 ( 不要 )实际配置0.1M PBS(pH 7.5):3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.5ml*3 次测定 =27ml; （实际配置50 ml ）6mMDTNB: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.2m

31、l*3次测定 =10.8ml; （实际配置50 ml，实际用量 0.1189g ）2mMNADPH:3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量 18.1mg）(1U)GR : 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3次测定 =5.4ml; （实际配置 50 ml,实际用量 10ml ）5磺基水杨酸： 3个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.01ml*3 次测定 =0.54ml; （实际配置10ml）( 实际用量0.5g/10ml)60.5mM PBS: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1.5ml

32、*3次测定 =81ml;（实际配置100 ml ）乙醚（二乙醚）: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *10ml*3 次测定 =540ml;（实际配置1000 ml ）PBS Buffer 0.5mM:3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1.5ml*3次测定 =81ml;（实际配置150 ml ）2- 乙烯吡啶 :3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.2ml*3次测定 =10.8ml;（实际用量20 ml ）乙醚 : 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *10ml*3次测定 =540ml;（实际用量1000 ml ）1标线制作：配制浓度为0， 0.02mM,0.04mM

33、,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM 的标准GSH溶液（吸取上述标准液各0.1mL ） 加 入0.5mL0.1M磷 酸 钠Buffer（ pH7.5 ） ( 含5mM EDTA)， 0.2mL6mM DTNB,0.1mL 2mMNADPH,0.1mL(1U)GR（谷胱甘肽还原酶） (sigma), 从 0.1mL GSH 启动反应，测定 650s 的 A412（OD412），绘制标准曲线。以 PBS代替 DTNB作空白。3 GSH（ 还原型谷胱甘肽） 及 GSSH（ 氧化型谷胱甘肽）（ 1）取 1g 新鲜叶片，加入 10 L（可以取 0.2g 鲜样，加 1.6ml 提取液）

34、5磺基水杨酸，研磨后在 14000g 离心 10 分钟，取 1mL上清液，加入 1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5 ）中，再用 5mL 乙醚（二乙醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，而乙醚处于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，反复进行两次即为抽取两次），此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。各取 1mL 上清液，加入1.5mL PBS Buffer 0.5mM (pH7.5),0.2mL 2-乙烯吡啶（原装试剂浓度）混合至乳胶状，在 25反应 1 小时，再用 5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提 2 次，此提取液用于分析 GSSGGSSG氧化型谷胱甘肽， GSH还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到还原型谷胱甘肽含量（GSH）（ 2 ）取反应混合液（ 0.5mL