丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库

1、丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库nbsp;nbsp;摘要：目的nbsp;nbsp;用含丙型肝炎病毒核心(HCVnbsp;core)蛋白的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体，并进行人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定。方法nbsp;nbsp;PCR扩增含HCVnbsp;core蛋白不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再亚 刘敏，张伟，陈天艳，蔺淑梅，赵良，刘锦锋，赵英仁，张树林 西安交通大学学报（新） 2006 年 2 月 第 27 卷 第 1 期 摘要：目的 用含丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵

2、载体，并进行人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定。方法 PCR扩增含HCV core蛋白不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。扩增人胎肝cDNA文库并纯化、鉴定。结果 获得含HCV core蛋白的cDNA片段，并成功克隆入pGBKT7中。待转化的人肝cDNA文库滴度在5108左右，纯化后的质粒 DNA质量浓度约1g/L。用EcoR、Xho双酶切显示插入片段大小不一。结论 成功构建了核心蛋白的酵母双杂交诱饵载体；扩增、纯化的人胎肝cDNA文库的多样性很好，适合于筛选。为用酵母双杂交技术研究与HCV core蛋白相互作用的蛋白打

3、下坚实基础。关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白；酵母双杂交；cDNA文库Construction of the bait vector of HCV core in yeast twohybrid systemand amplification, purification,evaluation of the cDNA gene bankfrom human fetal liverLiu Min, Zhang Wei, Chen Tianyan, Lin Shumei, Zhao Liang, Liu Jinfeng, Zhao Yingren, Zhang Shulin(Department of

4、Infectious Diseases, First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xian 710032, China)ABSTRACT: Objective To construct the bait vector of HCV core region in yeast twohybrid sys

5、tem, and to amplify, purify and evaluate the cDNA gene bank of human fetal liver. Methods The cDNA fragments encoding HCV core region were amplified by PCR, and then were cloned into pUC19. After being verified by sequencing, they were subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast twohybrid system,

6、 subsequently amplified and purified. And then the cDNA gene bank of human fetal liver was evaluated. Results The cDNA fragments of HCV core region were amplified successfully.The cDNA gene bank of human fetal fetal liver was about 5108; the purified DNA was about 1g/L; and the built in fragments we

7、re different in size after digested with EcoR and Xho. Conclusion The bait vector HCV core in yeast twohybrid system 3 is constructed successfully. The diversity of cDNA of human fetal liver after amplified and purified is suitable for screening. These lay a rigid basis for further study of the HCV

8、core protein and may help us in understanding how HCV works.KEY WORDS:HCV core protein; yeast twohybrid system; cDNA gene bank丙型肝炎病毒(HCV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因，全球超过1.7亿人口血清HCV抗体阳性。目前对于HCV感染尚无有效的预防疫苗，病毒蛋白对HCV感染细胞的功能影响还很不明确，利巴韦林和干扰素联合治疗仅对部分病例有效。这就迫切要求我们进一步了解病毒与细胞间的相互作用及免疫逃避机制。缺乏HCV感染和复制的组织培养系统、缺乏合适的H

9、CV感染动物模型是我们进行HCV发病机制研究所面临的主要障碍1。分子生物学技术的发展为我们的研究提供了新的思路。蛋白质与蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础2。酵母双杂交系统是近年来新发展起来的一种分析真核细胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的一种有效的基因分析方法。酵母双杂交Gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转化效率高，假阳性率低等优点，我们利用它来克隆与HCV 核心(core)蛋白相互作用蛋白的基因，以期为HCV core蛋白功能的研究提供新依据。1 材料与方法1.1 材料 含HCV全长cDNA质粒pCDNA3.0HCV由第四军医大学微生物教研室尹文博士惠赠；表达

10、载体pGBKT7酵母菌种(美国Clontech公司)；质粒pUC19菌种(本研究室保存)；PCR试剂盒、DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶(Gibco公司)；人肝酵母双杂交cDNA文库购自Clontech公司。1.2 方法1.2.1 PCR扩增 克隆编码核心蛋白的引物：引物P1：5GCCGAATTCATGAGCA CGAATCCTAAACCT3；引物P2：5GCGTCGACTTAGGCTGAAGC GGGCACAGT3。PCR反应条件为：94 30s, 55 60s，72 60s，30个循环 。1.2.2 PCR产物克隆及鉴定 纯化的PCR产物用EcoR和Sal双酶切，定向

11、克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5，进行蓝白筛选。酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆命名为pUC19core蛋白，进行序列分析。1.2.3 构建及鉴定诱饵载体 用EcoR、Sal酶切pUC19core蛋白和表达载体pGBKT7, 回收core蛋白及pGBKT7载体片段，载体片段与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5。经限制性内切酶分析，含正确插入片段的克隆命名为pGBKT7core蛋白。1.2.4 人胎肝cDNA文库的扩增、纯化与鉴定 按Clontech公司的说明书对文库进行扩增，用QIAGEN公司的操作手册对文库进行纯化。取纯化的文库质粒1L转化E.coli DH5感受态细胞，随机挑取10个单

12、克隆提取质粒，EcoR、Xho双酶切鉴定cDNA文库的多样性。2 结果2.1 Core蛋白基因片段编码区的扩增 可见扩增出与预期大小一致的cDNA片段(图1)。Core蛋白大小为588bp。图1 核心蛋白基因片段编码区扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）Fig.1 AGE analysis of PCR products encoding cDNA fragments of HCV core region geneM: DNA PCR marker; 1-6: HCV core2.2 重组pUC19core蛋白质粒的酶切鉴定及序列分析 鉴定正确的pUC19core蛋白重组质粒分别做正反向测序，序列分

13、析表明所扩增的core蛋白基因序列与登录的HCV core蛋白基因序列完全一致(图2)。图2 重组pUC19core蛋白质粒的EcoR、Sal双酶切鉴定（略）Fig.2 AGE analysis of recombinant plasmid pUC19core digested with EcoR, SalM: DNA PCR marker ; 1-2: pUC19core recombinant plasmid2.3 重组pGBKT7core蛋白质粒的酶切分析 重组质粒pGBKT7core蛋白的酶切鉴定结果见图3。图3 重组pGBKT7core蛋白质粒的EcoR、Sal双酶切鉴定（略）Fig

14、.3 AGE analysis of recombinant plasmid pGBKT7core digested with EcoR, SalM: DNA PCR marker; 13: pGBKT7 core recombinant plasmid2.4 人胎肝cDNA文库的扩增、纯化与鉴定 经测定，待转化的人肝cDNA文库滴度在5108左右，纯化后的质粒 DNA浓度约1g/L。用EcoR，Xho双酶切鉴定cDNA文库的多样性。结果显示插入片断大小不一(图4)。说明文库的多样性很好，适合于筛选。图4 经EcoR、Xho双酶切的cDNA文库的琼脂糖凝胶电泳结果（略）Fig.4 AGE an

15、alysis of cDNA gene bank digested with EcoR and Xho3 讨论酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法3。对于一种蛋白质，如能钓到与之相互作用的已知蛋白，将对其功能的研究具有明确的指导方向；如钓到未知功能蛋白，对于未知功能的新蛋白的研究将提供一个新的线索。Zhang 等4用酵母双杂交的方法鉴定了蛋白酶体亚单位PSMA7与HBxAg特异相互作用，提示蛋白酶体复合体是HBxAg的细胞靶位的功能基础。Harvey 等5为研究HBV受体使用酵母双杂交方法研究LHBsAg的前S1区筛选人肝文库，筛选到一个未鉴定蛋白。这个未鉴定蛋白

16、与谷光甘肽S转移酶(GST)表达成融合蛋白可以和HBV以直接方式结合。Ghosh 等6用酵母双杂交技术证明了NS5A与新鉴定的细胞转录因子SRCAP相互作用，可能是NS5A对细胞生长调节的机制之一。Shi 等 7也通过对HepG2和人肝cDNA文库的酵母双杂交筛选到apoA1，一个高密度脂蛋白成分，与NS5A相互作用，提示NS5A参与脂代谢紊乱的病理过程，可以解释HCV感染后普遍存在的肝脏脂肪变性。HCV core蛋白位于病毒多肽的氨基末端，被宿主的信号肽酶切割后产生。HCV core蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用810，其氨基酸序

17、列高度保守，临床和实验研究显示HCV core蛋白具有广泛的反式激活作用11。core蛋白对细胞信号转导途径，尤其是NFB、AP1和SRE相关途径具有明显的增强作用12；在HeLa和HepG2细胞系中HCV core蛋白与TNFR1胞浆区相互结合，影响TNFR1的信号传递，增加了TNF诱导的细胞凋亡，与细胞增殖、分化及慢性炎症形成等有关13。在HepG2细胞中，核心蛋白激活人类cmyc基因、RSV LTR和SV40早期启动子14；HCV core蛋白与p53协同破坏宿主细胞的完整性，干扰抗原递呈和免疫反应, 逃避各种非抗原特有效应因子清除HCV感染肝细胞，使病毒得以复制15。HCV进入肝细胞后

18、，病毒基因组及其编码的蛋白与肝细胞基因及蛋白之间的相互作用是决定HCV复制、表达、免疫逃逸、慢性感染、肝纤维化及致恶性转化的关键因素之一。HCV core蛋白具有广泛的反式激活作用。这种反式激活的作用机制，一方面是HCV core蛋白本身可以与感染的靶细胞基因组中相关启动子序列结合，影响基因表达；另一方面是HCV core蛋白与感染靶细胞核中转录因子蛋白进行结合，从而对于靶细胞基因的表达产生间接的影响。与宿主多种形式蛋白相互作用，可能是HCV感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因。本研究用pCDNA3.0core蛋白全长cDNA经PCR成功构建了融合有HCV core蛋白的重组表达质

19、粒pGBKT7core蛋白, 完成了胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定工作，为用酵母双杂交技术研究与core蛋白相互作用的蛋白打下坚实基础。参考文献：1Rosen HR, Gretch DR. Hepatitis C virus: current understanding and prospects for future therapies J. Mol Med Today,1999,5(9):393399.2Wang XZ, Jiang XR, Chen XC, et al. Seek protein which can interact with hepatitis B virus X

20、protein from human liver cDNA library by yeast twohybrid system J. World J Gastroenterol, 2002,8(1):9598.3FromontRacine M, Rain JC, Legrain P. Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive twohybrid screens J. Nat Genet,1997,16(1):277282.4Zhang Z, Torii N, Furusaka A, et al. St

21、ructural and functional characterization of interaction between hepatitis B virus X protein and the proteasome complex J. J Biol Chem, 2000,275(7):1515715165.5Harvey TJ, Macnaughton TB, Park DS, et al. A cellular protein which binds hepatitis B virus but not hepatitis B surface antigen J. J Gen Viro

22、l,1999,80(3):607615.6Ghosh AK, Majumder M, Steele R, et al. Modulation of interferon expression by hepatitis C virus NS5A protein and human homeodomain protein PTX1 J. Virology, 2003,306(1):5159.7Shi ST, Polyak SJ, Tu H, et al. Hepatitis C vires NS5A colocalizes with the core protein on lipid drople

23、ts and interacts with apolipoproteins J. Virology, 2002, 292(1):198210.8Otsuka M, Kato N, Taniguchi H, et al. Hepatitis C virus core protein inhibits apoptosis via enhanced BclxL expression J. Virology, 2002, 296(1):8493.9Andre P, KomurianPradel F, Deforges S, et al. Characterization of low and very

24、lowdensity hepatitis C virus RNAcontaining particles J. J Virol, 2002,76(14):69196928.10McLauchlan J. Properties of the hepatitis C virus core protein: a structural protein that modulates cellular processes J. J Viral Hepat, 2000,7(1):214.11Bergqvist A, Rice CM. Transcriptional activation of the int

25、erleukin2 promoter by hepatitis C virus core protein J. J Virol, 2001,75(2):772 781.12Kato N, Yoshida H, Kioko OK, et al. Activation of intracellular signaling by hepatitis B and C viruses: Cvirus core is the most potent signal inducer J. Hepatology, 2000, 32(2):405412.13Zhu N, Khoshnan A, Schneider R, et