凋亡素的研究近况

1、凋亡素的研究近况    摘 要：目的 建立筛选鉴定磷酸化修饰vp3激酶的实验方法，为初步观察其相关激酶的鉴定建立可行的实验方案。方法 采用pcr方法克隆vp3的cnda片段，将其插入质粒pgex-4t-2构建含gst标签pgex-4t-2-vp3原核表达载体，转化表达菌，iptg诱导融合蛋白表达，利用亲和层析纯化制备gst-vp3，以其作为诱饵蛋白，分别从人肝癌细胞hepg2及正常胎肝细胞l-02的总蛋白中，通过pull-down技术捕获与vp3相互作用的蛋白质，所得相关蛋白质经胶上原位酶活性检测法观察其激酶活性。结果 获取了高纯度的gst-vp3融合蛋

2、白，从hepg2及l-02细胞中捕获到与vp3相互作用的蛋白质，经胶上原位酶活性检测方法检测到激酶活性区带。结论 以gst-vp3蛋白为诱饵捕获的相关蛋白质中有磷酸化修饰vp3的激酶存在，应用胶上原位酶活性检测法可用于检测磷酸化修饰vp3的相关激酶。关键词：vp3；激酶；胶上原位酶活性检测法前言源自鸡贫血病毒蛋白，亦名凋亡素（apoptin）,它121个氨基酸组成，富含脯氨酸或碱性氨基酸和高比例的丝氨酸及苏氨酸残基，与其它任何已知动物或病毒蛋白不存在序列同源性1。vp3能特异性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无毒性。其活性的发挥与其在细胞内的定位密切相关2，在正常细胞中vp3定位于细胞质，而在肿

3、瘤细胞中则定位于细胞核3。vp3的核定位与其108位丝氨酸的磷酸化与否密切相关，这提示在转化细胞或肿瘤细胞内存在某种激酶，该激酶在转化细胞或肿瘤细胞内能使vp3（108位丝氨酸）发生磷酸化，被磷酸化的vp3在核内聚集，诱导肿瘤细胞凋亡，在正常细胞内vp3不被磷酸化而均匀分布于细胞质中4，但迄今为止该激酶尚未被检出。已有的研究提示：在vp3发挥其活性的过程中可能有多种激酶56 或蛋白567参与，鉴于直接磷酸化修饰vp3的激酶及其相互作用的激酶，在其特异性诱导肿瘤细胞凋亡中的关键作用，该类激酶的筛检不但对于研究vp3的生物学功能和临床应用有重要作用，而且对肿瘤发生、发展的认识和肿瘤治疗靶点的选择上

4、均有重要意义1011。<br· 上一页· 1· 2· 3· 4· 5· 6· 下一页        本研究获取纯化带gst标签的gst-vp3融合蛋白，以其作为诱饵，通过pull-down技术，分别在肝癌细胞hepg2与正常肝细胞l-02中捕获与gst-vp3相互作用的蛋白质，经胶上原位酶活性检测，以初步观察此方法用于筛选和鉴定磷酸化修饰vp3相关激酶的可行性。方法重组质粒的构建根据已知的vp3基因序列设计上下游引物，引物序列如下

5、：上游引物：5-cggaattcatgaacgctccaagaagatactc-3下游引物：5-acctcgagttacagtcttatacgcctttttctcgg-3。其中上游引物的5含有起始密码和限制性内切酶ecor i酶切位点，下游引物含有xho i酶切位点。以重组质粒pcdna3-vp3为模板扩增目的片段，扩增条件为：94 5min; 94 55s, 60 50s, 72 55s，30个循环；72 10 min12。pcr扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。产物及载体pgex-4t-2（购自amersham公司）经ecor i、xho i双酶切，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，回

6、收0.4kb和5.3kb大小的片段进行连接，构建原核表达载体pgex-4t-2-vp3，如图1.示。转化e. coli dh5，筛选获得阳性重组体，经酶切鉴定后进行dna序列分析。重组质粒的表达与蛋白纯化重组质粒pgex-4t-2-vp3转化表达菌株e. coli bl21（de3）plyss，接种于含0.05mg/ml氨卞青霉素的lb培养基中，37扩增培养，至od6000.6-0.8时加入iptg至终浓度为1.0mm，20诱导8h后，收集的菌体用pbs洗菌一次，重悬，超声破菌，离心收集上清。以下步骤按amersham bulk and redipack gst purification mo

7、dules操作手册进行，0.45m过滤上清液，调节上清液中还原型谷胱苷肽浓度至20mm，上柱（glutathione sepharose 4b，amersham），自然流速，用含20mm，40mm，100mm，200mm还原型谷胱苷肽的pbs洗脱液进行洗脱。12% sds-page检测融合蛋白的纯化结果，合并只含有目的蛋白的收集管。经pbs透析，bca法测定蛋白质浓度。<br· 上一页· 1· 2· 3· 4· 5· 6· 下一页      

8、0; 捕获细胞总蛋白中与gst-vp3作用的蛋白质细胞培养人肝癌细胞hepg2及人胎肝细胞l-02（购自武汉大学中国典型物培养保藏中心）在含10胎牛血清，100iu/ml青霉素和100 g/ml链霉素的rpmi l640培养基（l-02细胞的培养基中含0.25iu/ml胰岛素）中，5co2，37常规培养。细胞总蛋白的制备取37贴壁培养的人肝癌细胞hepg2及人胎肝细胞l-02，分别用pbs洗3次，胰酶消化后收集细胞。按6倍细胞湿体积加入2×细胞裂解液 (40mm hepes ph7.4， 40 mm mgcl2，300 mm nacl，2m pmsf，10mm na3vo4

9、，10mm naf)4和2×pbs，冰水浴超声破碎细胞。18000g，4，离心30min，上清即为制备的细胞总蛋白6。bca法测定蛋白质浓度。诱饵蛋白的固化将纯化的gst-vp3蛋白总量500g，加入1m1，50glutathione sepharose 4b，室温结合1h，1000g，1min，4离心收集沉淀。1×pbs重复洗柱4次。与gst-vp3作用的相关蛋白的捕获将hepg2和l-02的细胞总蛋白各4 mg，分别加入上述固化含有gst-vp3的glutathione sepharose 4b中，颠倒混匀，4孵育1h；500g，4离心90s，收集沉淀；加入结合缓冲溶液

10、，混匀，500g，4离心90s，收集沉淀；重复洗柱5次，再加入含200mm还原型谷胱甘肽的结合缓冲液混匀，室温静置10min，1000g，4离心，90s，收集洗脱的组分，重复洗脱3次。同时以gst与细胞总蛋白作用，作为不含诱饵蛋白捕获相关蛋白的对照。捕获的相关蛋白经12% sds-page检测，银染法显色。胶上原位酶活性检测法检测激酶活性按13制备12% 8ml的sds分离胶，胶内gst-vp3的浓度为0.5mg/ml；同时再制备12%，8ml的sds分离胶，胶内gst的浓度为0.5mg/ml，作为空白对照。常规方法制备5%的浓缩胶。将所得相关蛋白质、人肝癌细胞hepg2及人胎肝细胞l-02总

11、蛋白等量上样于两块凝胶中，电泳结束后，将凝胶放入sds清除缓冲液（50mm tris-cl, ph 8.0；20%异丙醇）中，500 ml/胶，室温，置摇床上清洗1h，其间更换3次sds清除缓冲液；将凝胶移至变性缓冲液（50mm tris-cl, ph 8.0，5mm ?巯基乙醇，6 m盐酸胍）中，10倍以上胶体积，室温，置摇床上变性1h；凝胶移至复性缓冲液（50mm tris-cl, ph 8.0，5mm ?巯基乙醇，0.04% (v/v) tween 20）中，100 ml/胶，4摇床复性16 h以上，其间至少更换4次经预冷的复性缓冲液；凝胶移至激酶缓冲液（40 mm hepes, ph

12、7.6，2 mm dtt，0.1 mm egta，10 mm 醋酸镁）中，室温置摇床30 min，弃激酶缓冲液，加含有 20 m atp和10 ci/ml -32p-atp（购自amersham公司）的激酶缓冲液15 ml/胶，30摇床上保温60-90 min；弃含同位素的激酶缓冲液，加终止液（5% (w/v) 三氯醋酸，1% (w/v) 焦磷酸钠）终止反应，再用终止缓冲液洗胶，室温，置摇床上洗胶过夜，其间至少更换4次终止液；取出凝胶，磷屏（amersham）曝光7h以上，typhoon 9410（amersham）激光扫描仪获取放射自显影图像。<br· 上一页· 1

13、· 2· 3· 4· 5· 6· 下一页        结果重组质粒pgex-4t-2-vp3的鉴定重组质粒pgex-4t-2-vp3经ecor i与xho i双酶切，经琼脂糖凝胶电泳观察到约0.4 kb的vp3片段和4.9 kb大小的片段；重组质粒测序与genbank目的基因核对序列正确无误。融合蛋白和gst蛋白的诱导表达及纯化重组质粒转化表达菌株e.coli bl21(de3)plyss后，含重组质粒pgex-4t-2-vp3表达菌表达的可溶性总蛋白经

14、12sds-page电泳，结果显示：iptg诱导表达的菌体可溶性总蛋白电泳条带在融合蛋白相应位置(约40ku和26ku)出现浓染带，且与相应纯化的单一的融合蛋白条带处于同一位置，未诱导菌蛋白条带在相应位置较诱导菌蛋白条带弱。<br· 上一页· 1· 2· 3· 4· 5· 6· 下一页        技术捕获细胞中与gst-vp3相互作用的蛋白质纯化所得的gst-vp3作为诱饵蛋白分别与肿瘤细胞hepg2及正常细胞l-02总蛋白作

15、用， pull-down技术捕获的相关蛋白经sds-page银染结果显示：固化gst-vp3和gst与肿瘤细胞hepg2裂解液孵育后捕获的蛋白质组分，有较明显的差异，尤其是蛋白分子量在35-45ku之间可见显着差异的条带；而正常细胞l-02裂解液中未见二者有明显差异的条带。胶上原位酶活性检测法检测捕获相关蛋白中的激酶组分经胶原位酶活性反应和放射自显影成像，在图5.上可见明显条带，提示：该条带所在位置处有与vp3相互作用激酶组分并且其活性可被检测到。在空白胶的相应位置上没有检测到激酶活性条带。讨论能特异性诱导肿瘤细胞凋亡。此活性的发挥与其108位丝氨酸的磷酸化与修饰相关3。新近的报道又提示，在肿

16、瘤细胞内，pi3k/akt信号通路在vp3特异诱导肿瘤细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。pi3k和akt虽非直接磷酸化修饰vp3的激酶，但vp3可能通过与pi3k的p85亚基相互作用别构激活pi3k8，被激活后的pi3k/akt信号通路中，磷酸化的akt与vp3共定位于核内，进而对vp3的核定位和诱导肿瘤细胞凋亡又起了至关重要的影响9。由此看来，vp3在肿瘤细胞中发挥的特异性凋亡诱导作用可能与多种激酶相关，涉及影响到复杂的胞内信号转导系统，从而启动了特定的凋亡途径。鉴于多种激酶均有可能参与vp3引发的凋亡效应1415。筛选鉴定磷酸化修饰vp3激酶和与vp3相互作用激酶对于探讨vp3的生物学功能及其临床应用均具有重要意义。胶上原位酶活性检测技术提供了在体外检测特定激酶使其相应底物磷酸化的实验方法，候选激酶（