第五章 种子的扩大培养

1、发酵工程学发酵工程学http:/ 河南科技大学河南科技大学食品与生物工程学院食品与生物工程学院64282335 行政楼行政楼303 64282790 行政楼行政楼419 Email: http:/ 种子的扩大培养种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备实例(不同菌种和产品不同菌种和产品)种子制备的技术概要种子制备的技术概要内容提要内容提要http:/ 是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处的生的生产菌种接入试管斜面产菌种接入试管斜面，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐, ,最终获得一定最终获得一定的纯种过程

2、。这的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。些纯种培养物称为种子。第一节 种子扩大培养的目的与要求一、几个概念一、几个概念http:/ 种子扩大培养的目的与要求一、几个概念一、几个概念2.2.接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液 的体积的百分数的体积的百分数3.3.种子级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数种子级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数4.4.发酵级数：种子级数加一发酵级数：种子级数加一5.5.种龄：生产种子的培养时间种龄：生产种子的培养时间http:/ 接种量接种量的需要的需要( (细胞浓度细胞浓度) )q 菌种的菌种的驯化驯化

3、（酶系）（酶系）q 缩短发酵时间、保证缩短发酵时间、保证生产生产水平（发酵效率、抗菌能力）水平（发酵效率、抗菌能力）q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体、遗传稳定生理状况稳定，个体与群体、遗传稳定q 活力强，移种至发酵后，能迅速生长活力强，移种至发酵后，能迅速生长q 无杂菌污染，适应能力强无杂菌污染，适应能力强第一节 种子扩大培养的目的与要求二、二、种子扩培的目的种子扩培的目的三、三、种子的要求（种子的要求（活力、状态、数量、纯度、抗性活力、状态、数量、纯度、抗性）http:/ 种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备二、青霉素生产的

4、种子制备二、青霉素生产的种子制备http:/ 谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌, 细胞短杆至细胞短杆至小棒状，有时微弯曲棒状，无小棒状，有时微弯曲棒状，无鞭毛，不运动；鞭毛，不运动；不形成芽孢不形成芽孢；革兰氏染色阳性；要求生物素革兰氏染色阳性；要求生物素作为生长因素；在通气条件下作为生长因素；在通气条件下发酵糖类生产发酵糖类生产L-谷氨酸。谷氨酸。 生物素为其生长的必需因素，加入适生物素为其生长的必需因素，加入适量的硫胺素和蛋白质水解物有促进细菌量的硫胺素和蛋白质水解物有促进细菌生长和生长和L-谷氨酸积累的作用。工业上用谷氨酸积累的作用。工业上用于生产助鲜剂于生产助鲜剂味精。味精。显微照片来自Phi

5、lip Lessard 博士 江南大学中国高校工业微生物资源数据平台 http:/ 种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备种子制备种子制备1.1.种子制备的基本流程种子制备的基本流程http:/ 0.5 0.5 琼脂琼脂 2%2%，pH7.0-7.2pH7.0-7.2(3)(3)培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细(2)(2)培养条件：培养条件：3232，生长生长18-2418-24小时小时(4)(4)生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过3 3次次第二节 种子制

6、备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备2.2.实验室阶段实验室阶段斜面斜面 (AS1.299)(AS1.299)不超过不超过3 3次次http:/ 种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备2.2.实验室阶段实验室阶段一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）(1)(1)培养基：培养基：2%2%，尿素，尿素0.5%0.5%， 2.5%2.5%，K K2 2HPOHPO4 4 0.1%0.1%(3)(3)培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本 (2)(2)培养条件：培养条件：于于1000ml1000ml

7、三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32 200-250ml,32 培养培养12h12hhttp:/ 种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备(1)(1)培养基：培养基：和一级种子相似，葡萄糖用和一级种子相似，葡萄糖用代替，代替， 浓度为浓度为2.5%2.5%(3)(3)培养基特点：培养基特点：有利于长菌体，使用原料更有利于长菌体，使用原料更(2)(2)培养条件：培养条件：在种子罐中培养，在种子罐中培养，3232培养培养7-107-10个小时个小时http:/ 8-10-109 9个个/ml/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.

8、0-7.2PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.26.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛4. 4. 种子质量种子质量第二节 种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备 2004 34(3)何宁http:/ 种子制备过程举例二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备 青霉 .在气生菌丝上 产生简单的长而 直立的分生孢子梗,顶端以特殊的对称或不对称的扫帚状的方式分支,称为帚状枝.分支为多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗,在瓶梗上着生分生孢子链.为球形至卵形,呈绿色,蓝色或黄色,即通常看到的各种青霉菌落特有的颜色. http:/ 斜面孢子斜面孢子 大米孢子

9、大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵1. 1. 种子制备的基本流程种子制备的基本流程第二节 种子制备过程举例二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备种子制备种子制备http:/ 2. 实验室阶段实验室阶段第二节 种子制备过程举例二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备(1)(1)培养基：培养基：(3)(3)培养基特点：培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细(2)(2)培养条件：培养条件： 2525、7 7天天, , 注意湿度注意湿度50%50%左右左右http:/ 2. 实验室阶段实验室阶段第二节 种子制备过程举例二、青霉素生产的种子

10、制备二、青霉素生产的种子制备(1)(1)培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）(3)(3)培养基特点：培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的 传质，营养适当（要求大米的白点小）传质，营养适当（要求大米的白点小）(2)(2)培养条件：培养条件： 2525、7 7天，控制湿度天，控制湿度(4)(4)生长斜面要求：生长斜面要求： 1 1粒米含粒米含1.41.4* *10106 6个孢子个孢子http:/ 3. 生产车间阶段生产车间阶段第二节 种子制备过程举例二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备(1)(1)培养基培

11、养基: :（葡萄糖（葡萄糖/ /蔗糖）玉米浆蔗糖）玉米浆(3)(3)接种量接种量: :200200亿孢子亿孢子/ /吨吨(2)(2)培养条件培养条件:25:25、40h40h(4)(4)目的求目的求: :孢子萌发、孢子萌发、长菌体长菌体3. 3. 生产车间阶段生产车间阶段二级种子二级种子(1)(1)培养基培养基: :同上同上(3)(3)接种量接种量: :10%10%(2)(2)培养条件培养条件:25.:25.10-14h10-14h(生产车间阶段生产车间阶段)http:/ 种子制备过程举例二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备4. 4. 种子质量要求种子质量要求(1)(1)菌丝长稠呈

12、丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 注：青霉素发酵菌丝体的生长共分为注：青霉素发酵菌丝体的生长共分为6 6个期，个期， 长菌丝长菌丝为主为主, , 产单位为主；产单位为主； 放罐放罐 或者:(1) 菌落生长繁殖期：孢子发芽，分枝旺盛，菌浓增加快，染色深。(2) 分泌期：菌落生长趋于减弱，补料加以调控，加入前体，保证产单位。 (3) 菌落自溶期：菌落衰老（应在此之前做好放罐，保证提炼不乳化）。 http:/ 种子制备过程举例a.a.菌种活化及逐级扩培菌种活化及逐级扩培b.b.培养基设计原则培养基设计原则c.c.种子质量种子质量( (质和量质和量) )d

13、.d.扩培阶段扩培阶段三、两种生产种子制备工艺的简单比较三、两种生产种子制备工艺的简单比较a.a.培养物选择不同培养物选择不同b.b.培养基设计不同培养基设计不同c.c.扩培过程扩培过程1.1.相同之处相同之处2.2.相异之处相异之处http:/ 种子制备技术概要一、种子制备的基本过程一、种子制备的基本过程http:/ 实验室种子制备生产现场种子制备 二级斜面一级斜面 米孢子 母瓶 子瓶 一级种子罐 发酵罐 二级种子罐 三级种子罐第三节 种子制备技术概要一、种子制备的基本过程一、种子制备的基本过程（实验室扩培）（实验室扩培）（活化）（活化）（生产车间扩培）（生产车间扩培）（保藏）（保藏）（接种

14、发酵罐）（接种发酵罐）http:/ 种子制备技术概要一、种子制备的基本过程一、种子制备的基本过程1.1.实验室阶段实验室阶段 ，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在设备，在工厂这些培养过程一般都在完成，因此现完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。http:/ 种子制备技术概要一、种子制备的基本过程一、种子制备的基本过程2.2.生产车间阶段生产车间阶段 种子培养种子培养里里面进行，一般在工厂中面进行，一般在工厂中归为归为，因，因此形象地称这些培养过此形象地称这些培养

15、过程为生产车间阶段。程为生产车间阶段。http:/ 根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：(1)(1)对于不产孢子和芽孢的微生物对于不产孢子和芽孢的微生物 对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是扩培最终是，如谷氨酸的种，如谷氨酸的种子培养。子培养。第三节 种子制备技术概要二、实验室阶段种子制备二、实验室阶段种子制备1. 1. 培养物选择的原则培养物选择的原则http:/ 菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。便于

16、操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。 根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：(2)(2)对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物第三节 种子制备技术概要二、实验室阶段种子制备二、实验室阶段种子制备1. 1. 培养物选择的原则培养物选择的原则b.b.获得一定数量和质量的获得一定数量和质量的( (链霉素、卡那链霉素链霉素、卡那链霉素) )http:/ 生长生长（好氧、厌氧）（好氧、厌氧），对孢子培养基应该是有，对孢子培养基应该是有的的 生长（生长（细菌、霉菌、放线菌）细菌、霉菌、放线菌）。(2)(2)在在，实验室种子培养阶段，规模比较小，因此，

17、实验室种子培养阶段，规模比较小，因此 为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较。第三节 种子制备技术概要二、实验室阶段种子制备二、实验室阶段种子制备2. 2. 培养基选择的原则培养基选择的原则http:/ 种子液种子液(2)(2)产孢子产孢子保藏保藏 母斜面母斜面 孢子瓶孢子瓶 第三节 种子制备技术概要二、实验室阶段种子制备二、实验室阶段种子制备3.3.起始接种物的传代问题起始接种物的传代问题http:/ :生产车间阶段，一般都是获得一定数量生产车间阶段，一般都是获得一定数量a.a.缩短发酵时间缩短发酵时间b.b.有利于获得好的发酵结果有利于获得

18、好的发酵结果(2)(2)原因原因-菌丝体比孢子要有利菌丝体比孢子要有利：第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备1. 1. 培养物选择的原则培养物选择的原则（染菌、单罐产量、设备利用）（染菌、单罐产量、设备利用）http:/ 此培养基的设计时首先考虑的是此培养基的设计时首先考虑的是，所以，所以(2)(2)在原料方面：在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是不如实验室阶段那么精细，而是，这有两个方面的原因，这有两个方面的原因: : a. a.一是成本一是成本 b.b.二是驯化二是驯化第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备2. 2.

19、 培养基选择的原则培养基选择的原则http:/ 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 蔗糖蔗糖 2.5-5% NH4NO3 0.225% 0.11%K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015%琼脂琼脂 2%第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备2. 2. 培养基选择的原则培养基选择的原则(3) (3) 培养基选择原则实例培养基选择原则实例柠檬酸发酵柠檬酸发酵/ /http:/ 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 薯干粉薯干粉 10% 22-28%(NH4)2SO4 琼脂琼脂

20、 2%第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备2. 2. 培养基选择的原则培养基选择的原则(3) (3) 培养基选择原则实例培养基选择原则实例柠檬酸发酵柠檬酸发酵/ /http:/ （小罐）（小罐）发酵发酵例例2.青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵(1)(1)定义：一般由定义：一般由开始计算发酵级数，但工厂多从开始计算发酵级数，但工厂多从开始计算发酵级数开始计算发酵级数第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备3. 3. 发酵级数的确定发酵级数的确定http:/

21、 般般2-42-4级。级。，第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备3. 3. 发酵级数的确定发酵级数的确定(2)(2)发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据http:/ 3）三级种子（三级种子（20m20m3 3)发酵（发酵（240m240m3 3) )背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%1%左右）左右）二级种子大种量（种子罐是发酵罐的二级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%5%以上）以上）文章：三级种子工艺文章：三级种子工艺采用三级种子的谷氨酸发酵工艺采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 ， 发酵科技通讯，发酵科技通讯，2003

22、,7http:/ %）规模规模保藏保藏牛肉膏牛肉膏 （英国）（英国） 1 1，蛋白胨（日本），琼脂粉（日本），蛋白胨（日本），琼脂粉（日本）1.81.8， 无机盐无机盐斜面斜面添加添加 0.10.1的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上一级一级口服葡萄糖口服葡萄糖 3 3， 玉米浆玉米浆 2.42.4，尿素，尿素 0.650.65，无机盐等，无机盐等1200 ml 1200 ml /5000 ml/5000 ml二级二级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 2.02.0， 玉米浆玉米浆 2.02.0 ，甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜 1.01.0, , 尿素尿素 0.350.35， 无机盐等无机盐等1.2 /

23、 2 m3三级三级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 4.04.0， 玉米浆玉米浆 1.51.5 ，甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜 1.01.0, , 液氨，复合维生素液氨，复合维生素 01 mg/L01 mg/L， 无机盐等无机盐等12 / 20 m3发酵发酵玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 13-1413-14， 玉米浆玉米浆 0.06-0.080.06-0.08 ，甘蔗甘蔗糖蜜糖蜜 1.01.0, , 液氨，维生素液氨，维生素 50 g50 g， 无机盐等无机盐等154 / 240 m3培养基成分表培养基成分表采用三级种子的谷氨酸发酵工艺采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 ， 发酵科技通讯，发酵科技通讯，2003,7

24、http:/ 种量更大（种量更大（7.2%7.2%），），生长速度快生长速度快：工艺工艺8 8小时产酸小时产酸（% %）1212小时产酸小时产酸（% %）发酵周期（发酵周期（h)h)三级种子三级种子5.25.2二级种子二级种子1.01.03535 糖酸转化率高且稳定糖酸转化率高且稳定(5(5万吨规模，可增加至少万吨规模，可增加至少30003000吨，吨，18001800万万) )工艺工艺产酸（产酸（% %）糖酸转化率糖酸转化率（% %）单罐产量单罐产量( (吨）吨）三级种子三级种子10.9310.9359.859.8212

25、1二级种子二级种子9.89.858581818采用三级种子的谷氨酸发酵工艺采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 ， 发酵科技通讯，发酵科技通讯，2003,7http:/ 移入种子的体积移入种子的体积 接种后培养液的体积接种后培养液的体积（1 1）接种量：过大过小都不好，）接种量：过大过小都不好，最终以实验最终以实验/ /实践定实践定，（如，（如大多数抗生素为大多数抗生素为7-15%7-15%。但是一般认为大一点好），。但是一般认为大一点好），接种量接种量也是影响生产的显著因素之一。也是影响生产的显著因素之一。第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备4. 4. 接种量的确

26、定接种量的确定http:/ 杨博， 中国油脂，2002 亚麻酸是一种人体必需亚麻酸是一种人体必需，它是人体，它是人体前列腺素的前体物质，在前列腺素的前体物质，在等方面具有重要的生理等方面具有重要的生理功能。因发酵法生产功能。因发酵法生产亚麻酸与从天然植物提取相比具有一亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系列优点，发酵法生产系列优点，发酵法生产亚麻酸成了当今研究的一个热点。亚麻酸成了当今研究的一个热点。 亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的丝状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵，而丝状真菌发酵亚麻酸亚麻酸时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。 http:/ fermentorfermentorSeed fermentor 接种方式：接种方式：单种、单种、双种、双种、混种及混种及倒种倒种fermentorhttp:/ 3）接种操作方式）接种操作方式 a.a.法法 一级种子罐一级种子罐b.b.一、一、二级种子罐二级种子罐第三节 种子制备技术概要三、生产车间阶段种子制备三、生产车间阶段种子制备4. 4. 接种量的确定接种量的确定bbhttp:/ (1) (1)定义：种龄是