HPLC法测定广东土牛膝中腺苷的含量(1)

1、HPLC法测定广东土牛膝中腺苷的含量(1)                             作者：卢绮雯，李坚，萧鹏，谢艳婷 【摘要】  目的 测定广东土牛膝中腺苷的含量。方法 采用反相高效液相色谱法，色谱柱：DiamonsilTM C18柱，流动相：甲醇磷酸盐缓冲溶液（体积比1288），流速：1.

2、0 mL·min-1 ，检测波长260 nm，柱温30 。结果 腺苷的平均回收率为99.5%，RSD值为1.69%;方法精密度试验RSD值为1.15%(n=6)。结论 该法可用于广东土牛膝中腺苷的含量测定。 【关键词】  广东土牛膝；腺苷；HPLC；含量测定 Abstract:Objective To determine the content of adenosine in Radix Eupalorri Chinense Linn by RPHPLC. Methods  Samples were analyzed on a DiamonsilTM C18 co

3、lumn（250 mm×4.6 mm，5 m） using  CH3OHNaH2PO4·Na2HPO4(1288)as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1 and the detection wavelength 260 nm. Results The method exhibited good linearity from 0.0396 to 0.6336 g. The average recovery for adenosine was 99.5% and RSD 1.69% (n=6).Conc

4、lusion  The method could be used to determine adenosine content in Radix Eupalorri Chinense Linn. Key words:Radix Eupalorri chinense Linn; adenosine; RPHPLC      广东土牛膝（Radix Eupalorri Chinense Linn）为菊科植物华泽兰的干燥根及根茎，广东土牛膝资源丰富，分布较广，在民间沿用历史悠久，具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛的功效1,2，临床上常用于治疗

5、各种咽喉炎、扁桃腺炎等。为评价广东土牛膝的内在质量，本文以腺苷为指标成分3，建立了广东土牛膝中腺苷含量测定的高效液相色谱法，该法具有分离效果好，简便、准确等优点，可用于该药材的初步质量控制。 1仪器和试药 1.1仪器    日本岛津高效液相色谱仪 (LC10ATvp溶剂输送泵，SPD10Avp紫外可见检测器，CTO10Asp柱温箱)，HW2000色谱工作站（南京千谱软件公司）。 1.2药材来源及处理    土牛膝样品（批号20051102，东莞国药集团中药饮片有限公司，产地广东；批号20060109，东莞国药集团中药饮片有限公司，产地

6、广东；批号0500201，佛山康泰和医药有限公司中药饮片加工厂，产地广东），由广东药学院生药学教研室刘基柱副教授鉴定为菊科泽兰属植物华泽兰(Eupalorri chinense Linn)的根及根茎。将其粉碎，于60 下干燥4 ，置干燥器内备用。 1.3药品与试剂    腺苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号879-200202，供含量测定用）；甲醇为色谱纯，水为双蒸水，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为分析纯。 2实验部分 2.1溶液的制备 2.1.1供试品溶液      取本品粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，

7、置具塞锥形瓶中，精密加入50%（体积分数）的甲醇20  mL，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用50%（体积分数）甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。 2.1.2对照品溶液      精密称取腺苷对照品9.90 mg，置50 mL量瓶中，加50%（体积分数）的甲醇适量，振摇使溶解，再加50%（体积分数）的甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为198 g· mL-1的腺苷对照品贮备液。 2.2色谱条件及系统用性试验    色谱柱：DiamonsilTM(钻石) C18柱（250

8、mm×4.6 mm，5 m，迪马公司）；流动相：甲醇磷酸盐缓冲溶液取0.01 mol·L-1磷酸二氢钠68.5 mL与0.01 mol·L-1磷酸氢二纳31.5 mL混合（pH6.5） （体积比1288）；流速：1.0 mL·min-1，检测波长：260 nm；柱温：30 。分别取对照品溶液（腺苷浓度为7.92 g· mL-1），供试品溶液20 L注入色谱仪，按上述色谱条件，记录色谱图（图1,2）。腺苷和样品中相邻色谱峰的分离度大于1.5；理论塔板数以腺苷峰计算不低于3 000；保留时间约为17.40 min。 1 2 图1腺苷对照品HPLC图

9、略 图2广东土牛膝药材样品HPLC图略 2.3方法学考察 2.3.1线性与范围    分别精密吸取一定量的对照品贮备液用50%（体积分数）的甲醇稀释成浓度为1.98、3.96、7.92、15.84、23.76、31.68 g· mL-1的对照品溶液，分别取20 L进样测定，以峰面积（A）对对照品质量浓度（）进行回归，得回归方程A=32 416.91+1 071.34，r=0.999 9，试验表明腺苷在0.039 60.633 6 g之间与峰面积线性关系良好。 2.3.2精密度试验     取质量浓度为7.92 g&

10、#183; mL-1的腺苷对照品溶液20 L，连续测定5次，记录峰面积并计算，结果腺苷峰面积的平均值为256 682，RSD为0.72%，表明仪器精密度良好。 2.3.3稳定性试验     取土牛膝供试品溶液（批号20051102），在0、2、4、8、12 分别进样20 L，记录峰面积，结果腺苷峰面积的平均值为229 720，RSD为1.69%，表明供试品溶液在12 h内稳定。 2.3.4重复性试验      取同一批号（批号20051102）样品6份，按“2.1.1”项下方法制备溶液，分别进样测定，结果

11、腺苷平均含量为0.1406 mg·g-1，RSD为1.15%，表明分析方法精密度良好。 2.3.5加样回收试验      精密称取已知含量（批号20051102）土牛膝样品约0.5g，共9份，分别用刻度吸量管精密加入浓度为198 g· mL-1的腺苷对照品溶液0.23、0.23、0.23、0.36、0.36、0.36、0.50、0.50、0.50 mL，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 L进行分析，结果见表1。       

12、                      表1腺苷回收率试验结果略 2.4样品测定      取土牛膝样品3批，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别取7.92 g· mL-1的对照品溶液与供试品溶液各20 L，注入液相色谱仪，测定，计算腺苷的含量，结果见表2。 表2样品的测定结果（略） 3讨 论  3.1提取

13、溶剂的选择分别用不同体积分数（30%、50%、70%、90%）甲醇混合液进行试验，结果腺苷的含量分别为0.139 8 、0.140 8、0.138 3、0.126 7 g· mL-1，表明用体积分数为50%的甲醇溶剂提取比较完全。 3.2腺苷提取方法选择文献4-7主要用超声处理和加热回流方法,本文考察了以50%（体积分数）甲醇为提取溶剂，样品分别超声处理和回流处理，结果腺苷的含量分别为0.140 8、0.138 5 g· mL-1,并且超声处理45 min与60 min的结果一致，因此选择45 min作为提取时间。 3.3检测波长的选择取腺苷对照品溶液，用50%（体积分数）

14、甲醇溶液做参比，置紫外可见分光光度计仪器中，在210400 nm波长扫描，结果腺苷对照品溶液在260 nm处有最大吸收波长,故选择260 nm作为检测波长。 3.4流动相的选择曾参考中国药典2005年版一部“冬虫夏草”的腺苷含量测定方法5，以甲醇pH6.5磷酸盐缓冲溶液（体积比17 3）作为流动相条件，但在试验过程中，我们发现在这种流动相条件下腺苷与其他组分的峰的分离状况并不好，经过对柱温和不同比例的甲醇磷酸盐缓冲溶液流动相的试验，结果以甲醇pH6.5磷酸盐缓冲溶液（体积比1288），柱温30 时，土牛膝中腺苷可和其他组分基线分离，并且峰形良好，该法分离效果好，准确，可用于广东土牛膝药材的初步质量控制。 【参考文献】  1 梅全喜，吴惠妃.广东土牛膝的药用历史及现代研究概况J. 中医药学刊，2005,23(11):1995-1996.2 刘晓燕，曾晓春，江剑东.广东土牛膝抗炎镇痛的研究J.中医药学刊，2005,22(8):1566-1568.3 叶沛光，龙晓英，卢绮雯，等.复方土牛膝喷雾剂的研制J.广东药学院学报，2006，22（3）：