半乳糖抗小鼠CD3单克隆抗体的制备及其结合TIL后的趋肝性研究

1、    半乳糖抗小鼠CD3单克隆抗体的制备及其结合TIL后的趋肝性研究        提要报道以半乳糖为原料制得2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-D-半乳糖苷(IME)后，与抗小鼠CD3单克隆抗体共价偶联制得半乳糖抗小鼠CD3单克隆抗体，再与标记3H-TdR的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)结合。经动物试验表明，复合物较单纯TIL具有明显的趋肝性，且能较长时间地浓集于小鼠肝脏内，说明半乳糖抗小鼠CD3单克隆抗体可作为肝靶向载体将抗肿瘤药选择性地导向肝脏，可能为肝癌的生物导向治疗

2、开辟了新的途径。 关键词肝靶向载体半乳糖2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-D-半乳糖苷抗小鼠CD3单克隆抗体肿瘤浸润性淋巴细胞无唾液酸糖蛋白受体半乳糖基抗CD3单克隆抗体肝癌导向治疗PREPARATION OF HEPATIC TARGETING CARRIER GAL-ANTI-MOUSE-CD3-McAb AND STUDY OF ITS TARGETING PROPERTY AFTER COUPLING WITH TILSong ZhipinPang Qijie(Pharmaceutical Factory, West China University of Medical Scien

3、cesChengdu 610041)Ba MingchenHe ShengGuan ChangtianZhang Chongjie*(The First University Hospital,School of Basic Medicine*, West China University of Medical SciencesChengdu 610041)ABSTRACTA hepatic targeting carrier, galactosyl-anti-mouse-CD3-monoclonal antibody(Gal-anti-CD3-McAb),was synthesized by

4、 the covalent coupling of a carbohydrate bifunctional reagent, 2-imino-2-methoxyethyl-thiogalactose,to anti-mouse-CD3-McAb.The carrier was combined with3H-TdR labeled tumor infiltrating lymphocytes(TIL) and the animal tests showed that the TIL combining gal-anti-CD3-McAb had much better hepatic targ

5、eting trendency than TIL alone. These results indicated that Gal-anti-CD3-McAb was probably used as a hepatic targeting carrier of anti-tumor drugs. This study created a new way for hepatic cancer biological targeting treatment.Key WordsD-galactose2-imino-2-methoxyethyl-1-thiogalactoseAnti-mouse-CD3

6、-monoclonal anti-bodyTumor infiltrating lymphocytes (TIL)Asialoglycoproteins receptorGal-anti-CD3-monoclonal antibodyHepatic cancer targeting treatmentHepatic targeting carrier自发现无唾液酸糖蛋白受体(Asialoglyc-oprotein Receptor, ASGP-R)只存在于哺乳动物肝实质细胞表面后，相继报道了合成半乳糖基糖蛋白作为ASGP-R配体的方法15，并证实将其作为药物载体的良好靶向性58。配体中蛋白质部

7、分曾用到牛血清白蛋白2、多聚赖氨酸5、胎球蛋白6及人血清白蛋白7，表明ASGP-R对蛋白质部分的选择性不十分严格。抗小鼠CD3单克隆抗体(anti-mouse-CD3-McAb)是一种免疫球蛋白，含赖氨酸、精氨酸16%以上，这些碱性氨基酸上的氨基易与半乳糖偶联。肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TIL)是新一代抗肿瘤过继免疫效应细胞9，其中CD3+T细胞约占7080%，而anti-CD3-McAb能与T细胞膜上的CD3分子结合形成复合物。参照NGA合成方法4，以半乳糖为原料制得2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-D-半乳糖苷(IME)，进而与抗小

8、鼠CD3单克隆抗体偶联制得了新的配体半乳糖基抗小鼠CD3单克隆抗体(Gal-anti-mouse-CD3-McAb)。再将其与标记H3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)的TIL结合后，利用放射性标记考察了Gal-anti-mouse-CD3-McAb对TIL趋肝性及在小鼠体内分布情况的影响。通过荧光标记方法考察了TIL结合偶联了半乳糖的抗小鼠CD3单克隆抗体的结合率。1实验部分1.1材料D-半乳糖(上海试剂二厂)；大鼠抗小鼠CD3单克隆抗体(德国BM公司)；Sephadex G-100(Pharmacia Finechemicals, Sweden);IgG(军事医学科学院微生物流行病研究所)。肿

9、瘤浸润性淋巴细胞(基础医学院免疫学教研室)用肿瘤组织经酶消化、分离、培养、扩增制得10。同系昆明种小鼠(华西医科大学动物实验中心)；荧光标记单抗大鼠IgG(华美生物制品公司)；放射性核素3H-TdR(上海原子能研究所)；其余试剂均为化学纯或分析纯。1.2Gal-anti-mouse-CD3-McAb的合成照NGA的合成方法4，以半乳糖为原料先合成IME，再在缓冲液中与抗体偶联，其合成路线如下。合成过程中，各中间产物均经熔点及TLC检查，与文献值相符4。由于抗体价昂量少，为保证一次合成成功，先用与其结构及组成类似的小鼠McAb与IME偶联，摸清最佳的反应条件，再用大鼠anti-mouse-CD3

10、-McAb偶联。1.3Gal-anti-mouse-CD3-McAb的分离与糖密度测定样品经Sephadex G-100柱层析，以0.1mol/L NaCl水溶液为洗脱液，LKB紫外检测器在波长280 nm处监测蛋白洗脱曲线，自动部分收集器收集，合并蛋白峰各管后，用蒸馏水透析。以苯酚-硫酸法12检测糖含量，在280 nm处用分光光度法测蛋白(以IgG代McAb作标准曲线)11，计算出每摩尔McAb(平均分子量15000)所含半乳糖的摩尔数即为糖密度。制得的Gal-McAb糖密度为8587，Gal-anti-mouse-CD3-McAb糖密度为68.95。糖含量和蛋白含量的标准曲线分别为：A0.

11、0006+0.01716cr0.9995；A0.0048+0.00131cr=0.9992。1.4Gal-anti-mouse-CD3-McAb与标记3H-TdR的TIL结合1.4.1TIL的3H-TdR标记取TIL2.0×108加3H-TdR 600 Ci，在条件培养基中共同孵育15 h，使3H-TdR充分掺入到TIL中。计算TIL的3H-TdR标记效率为74%，TIL结合Gal-anti-CD3-McAb的结合率为85%。TIL3H-TdR标记率131.4.2结合及单细胞悬液的制备将标记3H-TdR的TIL平均分成A、B两份，每份含3H-TdR标记的TIL 1.0×10

12、8，A份加入Gal-anti-CD3-McAb 120g，在条件培养基中孵育2h，生理盐水洗脱，除去游离抗体；B份不加。用生理盐水调两份细胞至4ml，制成单细胞悬液。1.5小鼠体内放射性分布实验取小鼠24只，40天龄，体重1822g，雌雄不限，随机分为A、B两组。A组从尾静脉注入A种单细胞悬液200l，含Gal-anti-CD3-McAb-TIL 2.5×106；B组从静脉注入B种单细胞悬液200l，含TIL 2.5×106。分别在注射后1、2、4、8、12、24、48h断椎处死，测血、肺、肝、脾的3H-TdR放射活性。其分布以每mg样品(血液每l)的放射活性CPM值表示。

13、1.6TIL与Gal-anti-CD3-McAb结合率的测定取TIL 2.5×107加Gal-anti-CD3-McAb 30g，在条件培养液中孵育1.5h，加荧光标记单抗大鼠IgG(FHIC-IgG)60g后继续孵育2h，用生理盐水洗脱除去多余的FHIC-IgG，加生理盐水稀释至3ml，制成单细胞悬液，涂片，荧光显微镜下观察，计数两个视野的总TIL数和荧光标记TIL数，计算其荧光标记率，即TIL与Gal-anti-CD3-McAb的结合率。2结果与讨论2.1A、B两组小鼠的放射活性值(CPM值)见表1，从结果可看出，在同一小鼠体内，肺中放射性最高，肝、脾次之，血液最少。因为TIL分

14、子个体较大，粒径也较大，从外周静脉输入易聚集在肺、外周淋巴器官内，到达肝脏的数量相对较少。从表1还可看出，注射4 h后，肺脏每mg样品CPM值逐渐减少，肝、脾逐渐增多，仍以外周血最少。注射8 h后，A组小鼠每mg肝脏CPM值逐渐稳定在一定范围，且维持较长一段时间，B组小鼠每mg肝脏CPM值却逐渐减小，两组间存在明显差别。但两组小鼠每单位肺脏、脾脏、血CPM值均逐渐减小，两组间无显著差别。Table 1Radioactivity (CPM) of united sample after H3-TdR labelingT(h)SpleenLungLiverBloodABABABAB12481224

15、48表1资料不成正态分布，将其换算为常用对数(表2)，对其进行统计学处理。结果显示，A、B两组小鼠每mg肺、脾CPM值无显著差异(P0.5)，每l血液样本无显著差异(P0.2)，而两组小鼠每mg肝脏CPM值存明显差异(0.025P0.01)。 Table 2Logarithmic radioactivity(CPM) of united sample after H3-TdR labelingT(h)SpleenLungLiverBloodABABABAB1248122448P0.50.50.0250.2以上结果证实TIL结合偶联了半乳糖的anti-mouse-CD3-McAb后较单纯TIL具

16、有明显的趋肝性。而脾脏中无显著差异，说明这种趋肝性并不是由于肝脏对大分子的吞噬作用，而是由于肝细胞膜上的受体介导作用。2.2TIL输入人体后在肝脏内有良好的肿瘤部位聚集9。以上实验应用的是正常小鼠，肝脏内无肿瘤组织存在，影响了其在肝脏内的聚集数量，TIL在肝细胞表面与Gal-anti-CD3-McAb解离后仍可入血经淋巴再循环到淋巴器，结果TIL在肝脏组织中的数量相对较少。又由于TIL粒径较大，进入体循环后首先在肺动脉等处阻塞性聚集，比较起来，Gal-anti-CD3-McAb对TIL的趋肝性可能影响不甚明显。若为荷瘤肝脏，则TIL在肝脏聚集的数量可能更多一些。2.3TIL为新一代抗肿瘤免疫效

17、应细胞，其抗肿瘤作用较LAK细胞强50100倍，并对肿瘤组织有特异性9，其所含CD+3T细胞为7080%之间，易与anti-CD3-McAb结合，后者本身是一种免疫球蛋白，含赖、精氨酸达16%以上，能与半乳糖结合，且能在体外及体内促进TIL的增殖，增加TIL的抗肿瘤效应9。以上研究首次将半乳糖抗小鼠CD3单克隆抗体和TIL偶联在一起，既增加了TIL的肝靶向性，又可能提高TIL在肝脏内的增殖效率，从而提高TIL的抗肝脏肿瘤效应，为原发性肝细胞肝癌的生物导向治疗和过继免疫治疗提供了新的研究途径。 作者单位：宋志平庞其捷华西医科大学制药厂成都 610041巴明臣何生管昌田华西医科大学附一院成都 61

18、0041章崇杰基础医学院成都 610041参考文献1Lee YC, Stowell C, Krants MJ. 2-imino-2-methoxyehy-1-thioglycosides:new reagents for attaching sugars to proteins. Biochemistry, 1976,15(18)39562Mark J, Krent Z, Neil A, et al. Attachment of thioglycosides to proteins:enhancement of liver membrane. Biochem, 1976,1539633Davi

19、d R, Kenneth A, Robert C,et al.Technetium-99m galactosyl-neoglycoalbumin;preparation and preclinical studies. J Nucl Med, 1985,26(10)11574庞其捷，杨麟，钟裕国等.半乳糖新糖白蛋白的制备及其对肝特异性受体结合实验的研究.华西医科大学学报，1991，223685Fiume L, Busi C, Mattioli A, et al.Hepatocyto targeting of adenine-9-D-arabinofuranoside5-monophosphat

20、e(ara-AMP)couple tolactosaminated albumin. FEBS Lett, 1981,1292616庞其捷，贺于玲，李铜铃.肝靶向抗疟药NGA-PQ的合成及其抗疟作用.中国药物化学杂志，1994，42407Eric J, Robert W, Mariska V,et al.Hepatic and intrahepatic targeting of an anti-inflammatory agent with human serum albumin and neoglycoproteins as carrier molecules. Biochem Pharm, 1993,4512158范举正，李铜铃，庞其捷等.肝靶向抗病毒药NGA-ACV的制备及其趋肝性.药学学报，1