液相色谱电喷雾串联质谱同时检测血液中8种有毒生物碱

1、液相色谱电喷雾串联质谱同时检测血液中8种有毒生物碱         11-04-22 16:16:00     作者：熊小婷 吴惠勤    编辑：studa20【摘要】  建立了高效液相色谱电喷雾串联质谱同时检测血液中8种有毒生物碱的方法。血液样品经过乙酸铵氨水缓冲溶液(pH9)处理后，以甲醇提取，采用电喷雾电离(ESI)、多反应监测(MRM)方式，可同时对麻黄碱、毛果芸香碱、士的宁、阿托品、钩吻素子、马钱子碱、乌头碱、喜树碱

2、8种有毒生物碱进行定性和定量分析。在优化的条件下，上述前4种组分在1100 g/L范围内线性关系良好，后4种组分在2.5500 g/L范围内线性关系良好。8种有毒生物碱的提取回收率在83.1%104.0%范围内。士的宁、阿托品、马钱子碱、乌头碱和钩吻素子检出限为0.05 g/L，定量限为0.1 g/L;麻黄碱、毛果芸香碱、喜树碱的检出限为0.1 g/L，定量限为0.5 g/L。各组分的日内RSD小于9%，日间RSD小于10%。本方法操作简便快捷、选择性好、灵敏度高，适用于中毒诊断和法医毒物分析。 【关键词】  高效液相色谱， 电喷雾串联质谱， 多反应监测， 同时检测， 有毒生物碱，

3、血液            1 引 言天然结构生物碱是中草药的重要药效成分，而与此同时，因不当治疗、临床用药过量、误食、蓄意投毒等而导致的剧毒生物碱中毒的案件也时有报道。因此，建立快速、灵敏、可靠的中毒样品中痕量生物碱的分析检测方法具有重要意义。含有毒生物碱的植物分布极其广泛，在各科各属中均有分布，如毛莨科的草乌、附子等含有乌头碱;马钱科的马钱子含马钱子碱、士的宁，钩吻含钩吻素子;茄科的洋金花，曼陀罗等含阿托品。这些生物碱的结构复杂、类型多样，毒性大，中毒剂量很低(如：乌头碱小鼠经口L

4、D50为1.8 mg/kg，对人的中毒剂量(口服)为0.12 mg，致死量为35 mg1)，在中毒病人体液中含量极低，中毒无特异性临床表现，这些特性使得有毒生物碱的分析鉴定成为一个难题。目前，对于体液中有毒生物碱的检测常用的方法有高效液相色谱法(HPLC)2,3、气相色谱质谱联用法(GCMS)4,5以及液相色谱质谱联用法(LCMS)614。HPLC检出限通常在100 g/L以上4,5，很多情况下不能满足毒物鉴定的需要，且仅以保留时间进行定性分析存在不足，目标物浓度低时基质干扰严重、选择性差，易出现假阳性结果;GCMS适用于挥发性成分的分析，而生物碱大多为高沸点化合物，需要衍生化后才能进行分析，

5、操作繁琐。LCMS具有液相色谱的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度，并且可以得到化合物的相对分子质量、特征结构碎片等信息，其多反应监测技术可进一步提高灵敏度与选择性，在中毒样品的痕量分析方面具有很大的优势，利用LCMS技术检测生物样品中有毒生物碱的分析的大部分研究仅限于对某一种或来源相同的某几种生物碱的检测612，对来源不同的多种有毒生物碱检测的研究很少13,14，并且存在覆盖范围不广13，以及提取回收率低的不足14。本实验建立了同时对人血中多种来源不同有毒生物碱的LCMS/MS检测方法，并对方法的回收率、稳定性、重复性等进行了验证。此法可大大提高检测效率，避免漏检，已在实际检测工作中应用。

6、2 实验部分2.1 仪器与试剂1200 RRLC高分离度快速液相色谱仪、6410B Triple Quad三重四极杆质谱仪(美国安捷伦公司)。XK96A快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司);AS 3120超声波发生器(Auto Science公司); TDL40B离心机(Anke 公司);HGC12氮吹仪(上海欢奥科贸有限公司)。马钱子碱、士的宁、喜树碱、硫酸阿托品和硝酸毛果芸香碱(中国药品生物制品检定所)，乌头碱、钩吻素子和盐酸麻黄碱(天津一方科技有限公司)，纯度均>95%，用分析纯甲醇配制成100 mg/L标准储备液，储存于4 冰箱中。甲醇(色谱纯，SK Chemical公司)，

7、甲醇、氨水和乙酸铵(分析纯，广州化学试剂厂)， 二次蒸馏水(自制)。2.2 样品前处理取血液0.5 mL于10 mL离心管中，加入1 mL乙酸铵氨水缓冲溶液(pH9)，充分混匀，加入2 mL甲醇，涡流混合2 min，超声10 min，4500 r/min 离心10 min，取上清液，重复提取一次，合并上清液，45 下用氮气吹干，加入1.0 mL起始梯度流动相V(甲醇)V(100 mmol/L乙酸铵)=1溶解，过0.22 m微孔滤膜，待分析。2.3 色谱与质谱条件Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm× 2.1 mm， 1.8 m);流动相：1

8、0 mmol/L 乙酸铵水溶液(A)+甲醇(B)，流速：0.3 mL/min;梯度洗脱程序：01 min, 20%35% B; 14 min, 35% B; 45 min, 35%60% B;56 min， 60%70% B;67 min，70%20%B。柱温：30 ，进样量：5 L。电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式(MRM)，干燥气温度： 350 ，干燥气流速： 9 L/min，雾化气压力： 275.8 kPa，毛细管电压： 4 kV。3 结果与讨论3.1 提取条件的选择血液样品含有蛋白质，直接加入有机提取溶剂会导致样品中蛋白质沉淀，提取溶剂不易渗透进样品中;且生物碱一般具

9、有碱性，在碱性环境下可游离出来，易溶于有机溶剂。本实验在提取前加入两倍量的碱性缓冲溶液稀释样品，在提高分散程度的同时可使生物碱游离出来，加大在有机相中的分配比例。针对各生物碱的性质，考察了以乙醚14、乙醚二氯甲烷(11, V/V)、乙酸乙酯、氯仿、甲醇为提取剂的提取效果，其回收率分别为41.6%73.9%， 57.5%93.8%， 44.4%86.6%， 46.9%95.5%， 81.0%103.0%。可见，只有用甲醇提取时，8种生物碱的提取回收率都能达到80%以上，故选择甲醇为提取剂。3.2 色谱条件的优化考察了以0.2%甲酸水溶液、10 mmol/L 乙酸铵溶液和20 mmol/L 乙酸铵

10、+1%乙酸水溶液为流动相A，甲醇和乙腈为流动相B的分离效果。实验发现，以10 mmol/L 乙酸铵水溶液(A)+ 甲醇(B)为流动相可使各组分得到较好的分离和较好的响应。采用0.2%甲酸水溶液(pH3)与采用10 mmol/L 乙酸铵溶液(pH7)时，各组分的出峰顺序发生改变。A采用前者时出峰顺序为毛果芸香碱、麻黄碱、士的宁、阿托品、钩吻素子、马钱子碱、乌头碱、喜树碱，采用后者时出峰顺序为麻黄碱、毛果芸香碱、阿托品、士的宁、马钱子碱、钩吻素子、喜树碱、乌头碱，说明改变流动相的组成和pH值会影响溶质分子与流动相的相互作用，从而改变它们的保留行为。这8种生物碱都具有不同程度的碱性，在pH较高的流动

11、相中会更多地以游离的形式存在，疏水缔合作用更强;另一方面，喜树碱、毛果芸香碱含有内酯环结构、马钱子碱和士的宁含有杂环酰胺结构，在pH较高的环境中易开环形成羧酸盐，降低与键合相的疏水作用，改变保留状况。两方面的综合作用使各组分的保留值随pH的改变产生不同程度的改变，从而改变出峰顺序。3.3 溶剂效应的影响样品吹干后用甲醇溶解进样分析，进样2 L以上时，峰展宽现象很严重，峰形不佳;改用梯度洗脱中间段的流动相(60%甲醇)溶解，效果有所改善;用起始梯度的流动相(20%甲醇)溶解，效果明显好转，进样10 L仍能得到较好峰形。3种情况下进样5 L的MRM色谱图如图1所示。从图1可见，用不同溶剂溶解对先出峰组分的峰形影响较大，后出峰的组分几乎不受影响，这种情况是由于溶剂效应的影响所致。A： 甲醇(Methanol);B： 甲醇(Methanol)10 mmol/L 乙酸铵溶液(Ammonium acetate)=32(V/V);C： 甲醇(Methanol)10 mmol/L乙酸铵溶液(Ammonium acetate