金刚健骨片调节整合素β1、αⅤβ3表达水平的实验研究

1、金刚健骨片调节整合素1、3表达水平的实验研究     金刚健骨片调节整合素1、3 表达水平的实验研究#杨少锋1，李玲慧2，陈青1，姚共和1，邓博1，聂颖1，罗振华1，郭彦涛1*基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20094323120005)作者简介：杨少锋，（1974-），男，副教授，主要研究方向：颈椎病、腰椎间盘突出症、骨质疏松症等。通信联系人：姚共和，（1952-），男，主任医师，主要研究方向：脊柱外科疾病及退行性骨与关节疾病。E-mail:  0 引言45 骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征,导致骨骼脆性增

2、加和易发生骨折的全身性疾病。随着社会人口的老龄化,骨质疏松发病率越来越高,且以绝经后妇女为主。整合素是粘附分子的一种，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用，参与细胞的信号传递和功能调控。近年来，人们发现成骨细胞、破骨细胞表面均有整合索的表达，且与骨形成及骨吸收的调控有关，整合素与骨质疏松症的关系已成为目前的研究热点1。成骨细胞50 和破骨细胞表面表达不同类型的整合素受体，本实验选取成骨、破骨细胞各自的代表受体、3 进行观察2-4。“肾虚髓亏”是绝经后骨质疏松发病的中医病理本质，补肾法是中医药治疗骨质疏松症的核心治法。故本研究选用了补肾法的代表方金刚健骨片，该方为湖南省名老中医姚共和教授的

3、临床经验方，临床疗效显著。在此基础上进行实验研究，并从成骨-破骨细胞偶联及整合素表达水平的角度出发，有可能从更深层次揭示金刚健骨片治疗骨质疏松55 的机制。1 材料1.1 实验动物10 月龄清洁级Wistar 雌性大鼠,体重(350±20) g，共50 只，由湖南中医药大学实验动物中心提供。60 1.2 药物与试剂金刚健骨片：由补骨脂、熟地黄、川牛膝、鹿角胶、菟丝子、肉苁蓉、杜仲、粉萆、山药等九味中药组成，湖南中医药大学第一附属医院药剂科生产成片剂，（院）卫生剂08-043号，每片0.3 g，成人剂量每次1.5 g，一天三次；骨松宝颗粒：主要由淫羊藿、生地黄、牡蛎等九味中药制成，贵州

4、富华药业有限责任公司生产，黔卫药准字（1996）第山西亚宝药业65 （集团）100079 号，成人剂量为10 g/次，一天三次；福善美：由默沙东中国有限公司生产，每片10.0 mg，成人剂量为一次一片，一天一次。抗Itg1 单克隆抗体(Pharmingen 公司产品)；链亲和素-AB 复合物(Sigma 公司产品)。2 方法2.1 动物模型的建立70 2 %戊巴比妥钠以40 mg/kg 的剂量腹腔注射麻醉，常规手术消毒，俯卧位固定，约在肋下1.5 cm、脊柱旁开1 cm 处作长约2 cm 的纵向切口，完整摘除双侧卵巢，彻底止血后，分两层依次缝合肌肉、皮肤。假手术组（SHAM）以同样切口切除左右

5、两侧肠系膜各一段，其重量基本与卵巢重量相同。术后常规肌注青霉素，连续3 天。所有动物在相同的条件、环境下分笼饲养13 周月。75 2.2 动物分组与治疗采用完全随机法将去势大鼠分为5 组：福善美组(FSM)、金刚健骨片组（JGJG）、骨松宝颗粒组(GSB)、模型组(OVX)、假手术组（SHAM）。从去势术后第14 周起开始对5 组大鼠分别以不同药物连续灌胃13 周，模型组及假手术组的药物以生理盐水替代。根据药理实验方法学（第三版）进行人与动物等效剂量换算，灌胃剂量分别为：金刚健骨片（每只 大鼠每天80 0.13 g）；骨松宝颗粒（每只大鼠每天0.86 g）；福善美（每只大鼠每天0.2

6、8mg）。所有大鼠每周测量体重1 次，并按体重变化调整给药量。2.3 检测方法2.3.1 骨密度测定将大鼠颈椎脱臼处死后，取下大鼠右侧股骨,剔净附着的软组织，用双能X 线骨密度测85 定仪(DXA)测定股骨的骨矿密度。测量时选用小动物模式进行扫描，设定速度为60 mm·s，分辨率为1.0 mm×1.0 mm。2.3.2 整合素3 及1 测定取腰1 椎体于4 %多聚甲醛中固定12 小时，脱钙脱水，石蜡包埋，切成5 m 厚薄片，于体积分数为3 %过氧化氢中浸泡25 min，以阻断内源性过氧化物酶活性。自来水冲，蒸馏90 水洗；10 g/L 胰蛋白酶溶液(pH72)抗原修复，37

7、 ，10 min。蒸馏水洗，PBS 5 min 2 次；滴加生物素标记的抗Itg3（或Itg1）单克隆抗体(Pharmingen 公司产品)，抗体稀释度1:50，37 孵箱35 min，PBS 5 min 2 次；滴加链亲和素-AB 复合物(Sigma 公司产品)，稀释度1:200，37 ，40 min，PBS 5 min 2 次； DAB 显色，适时终止；苏木素复染，加拿大胶封片。阴性对照片不加一抗，改加1 mol/L PBS 缓冲液，其余操作步骤不变。95 2.4 统计学处理全部数据均采用spss18.0 统计软件包进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，再进行两两比

8、较，检验水准=0.05。3 结果3.1 骨密度测定100 见表1。各组间骨密度比较，差异有统计学意义（P<0.05）。SHAM 组骨密度值高于其余四组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗组骨密度值显著高于OVX 组，其中FSM 组与JGJG 组骨密度均高于GSB 组（P<0.05），而两组间并无明显差异（P>0.05）。表1 整合素表达比较（ x ± s ）Tab.1 Comparations of The Expression of Integrin组别 n 骨密度(gcm-2) 整合素1 整合素3SHAM 10 0.243±0.006 0.0

9、88±0.005 0.007±0.003FSM 10 0.218±0.008 0.027±0.003 0.012±0.004JGJG 10 0.214±0.009 0.036±0.003 0.016±0.004GSB 10 0.206±0.006 0.026±0.004 0.029±0.006OVX 10 0.183±0.007 0.010±0.002 0.073±0.010105 注：单因素方差分析：与OVX 组比较，P<0.05；与GSB 组比较

10、，P<0.05；与JGJG 组比较，P<0.05；与FSM 组比较，P<0.053.2 整合素表达见图1-2。将切片于高倍镜视野（×200）下观察并摄片，整合素1 的阳性表达信号为110 棕黄色团块，骨基质中的表达较弱，该受体在成骨细胞中的表达较为明显。观察结果显示：SHAM 组可见大量棕褐色团块，表达最为显著；JGJG 可见棕黄色团块，但密度不及SHAM组；FSM 组、GSB 组可见少量淡黄色团块；模型组整体呈现蓝紫色改变。整合素3 的阳 性表达的信号亦为棕黄色团块，OVX 组骨组织呈棕黄色，GSB 组亦可见棕色表达，但密度不及OVX 组；JGJG 组、

11、FSM 组可见少量棕黄色团块；SHAM 组基本呈现蓝紫色。115SHAM 组 FSM组 JGJG组 GSB组 OVX组图1 整合素1Fig.1 Integrin 1120SHAM 组 FSM组 JGJG组 GSB组 OVX组图2 整合素3Fig.1 Integrin 3125 运用图像分析软件Image-Pro Plus 5.0 计算每个视野下阳性表达的平均光密度值。平均光密度值=阳性表达的积分光密度值/视野总面积（不计空白）。由表2 可见，治疗组的整合素1 水平均显著高于OVX 组（P<0.05），其中JGJG 组高于FSM 组及GSB 组，差异具有统计学意义（P<0.05）；F

12、SM 组与GSB 组疗效相当（P>0.05）。治疗组整合素3 的表达水平显著低于OVX 组（P<0.05），其中FSM 组及JGJG 组均低于GSB 组，差异具有统计130 学意义（P<0.05），而二者之间并无明显差异，且FSM 组与SHAM 组比较亦无显著差异（P>0.05）。4 讨论骨质疏松症发病率逐年增高,且以绝经后妇女为主,成为目前老年女性常见的全身骨代谢性疾病,也是老年妇女骨折的重要原因。绝经后雌激素缺乏以及一些病理情况下，骨吸收过135 多或形成不足引起平衡失调最终会导致骨量减少和骨组织细微结构变化，导致骨质疏松。骨重建，是指旧骨组织被吸收和新骨组织形成的

13、过程。近年来普遍认为5在骨重建过程中，成骨-破骨细胞的偶联是骨重建的核心。以往的研究由于条件的限制，无论是促性激素，成骨细胞、破骨细胞活性，还是调节钙、微量元素及相关细胞因子，都很少从根本上涉及到成骨-破骨细胞偶联的关键问题，而要研究成骨-破骨细胞偶联问题，就必须涉及到整合素这一关140 键受体。整合素是破骨细胞上的一类跨膜蛋白，是由、 两个亚单位组成的异源二聚体。根据其 和 亚基的不同又分为多种类型，可介导细胞间及细胞与基质间的交互作用。代表3整合素的玻璃粘连蛋白受体(VnR)在许多组织广泛表达，但仅在破骨细胞上特异性的高表达，表明3 整合素对破骨细胞的功能有重要影响6。1 是成骨细胞所表达

14、的整合素的最主要145 的受体，促进成骨细胞分化、成熟7。故本研究选取整合素1 及3 分别作为成骨、破骨细胞的代表进行观察。在成骨-破骨细胞的偶联过程中，整合素受体通过三个主要方面对成骨-破骨细胞偶联进行调控：主导成骨细胞与骨基质蛋白的结合。成骨细胞与骨基质蛋白的结合能力与其表面 整合素的表达水平有关。在成骨细胞外的基质蛋白中，型骨胶原占95 %。研究发现，整150 合素1 识别并结合型骨胶原末端的GFOGFR 序列后可激活信号转导途径中的关键酪氨酸激酶-粘着斑激酶(FAK)活性，促进成骨细胞分化、成熟8。调控破骨细胞分化因子（ODF）。成骨细胞膜上的ODF，通过膜接触机制与破骨细胞

15、表面RANK 结合并活化NFB，引起胞浆和核内Ca 变化或通过JNKs（Jun N-termmal Kinases）催化c-Jun 磷酸化的作用，调节基因表达，促进破骨细胞后期的分化成熟。与破骨细胞ODF 关系密切的主要是整合素受体155 3，其在破骨细胞表面高水平表达，作为抑制骨吸收的靶点而备受关注9。在破骨细胞分化环路中起负调节作用。1997 年Simonet 首先分离出了一种可调节骨密度的蛋白，取名为护骨素(OPG)，也有学者10称其为破骨细胞生成抑制因子(OCIF)。它是一种分泌蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，由成骨细胞表达和分泌，在破骨细胞分化时起信号传导作用。作为

16、OPGL（OPGL 即成骨/基质细胞表面配体，这个配体具有直接传递信号给破160 骨前体细胞而诱导破骨细胞形成的作用）的伪受体，OPG能竞争性与RANK结合，阻断OPGL与RANK 的信号传递，抑制破骨细胞形成，在破骨细胞分化环路中起负调节作用。整合素受体可引导生长因子激活信号通路，刺激成骨细胞表达和分泌OPG11,从而使OPG 在破骨细胞分化环路中发挥重要的负调节作用。祖国医学将本病归入“骨痿”范畴。景岳全书·痿证云：“肾者，水脏也，今水不胜165 火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”。 肾为先天之本，主藏精，其充在骨，肾可主骨生髓，骨的生长、发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切

17、，肾、骨、髓之间存在病理联系。补肾法是中医药治疗骨质疏松症的核心治法，补肾中药对于骨质疏松症治疗效果已被大量的实验研究和临床应用证实12-13。我院著名湖南省名老中医姚共和教授以补肾法为纲领，自制金刚健骨片用以治疗骨质疏松症，在临床上已使用多年，且疗效显著。我们在此基础上进行170 实验研究，从成骨-破骨细胞偶联及整合素表达水平的角度出发，以进一步探索金刚健骨片治疗骨质疏松症的机理，为该药的临床应用提供实验依据，并为进一步筛选具有一定靶向性的治疗骨质疏松症的中药制剂提供新的思路。本研究对去势大鼠应用不同药物进行干预，通过免疫组化染色等方法，对其骨密度及整合素水平进行测定，从而得出以下结论：金刚健骨片能显著提高去势大鼠骨密度，其作用175 与福善美相当，二者均优于骨松宝