银杏叶提取物EGB761对肢体制动大鼠骨骼肌萎缩的防护效应

1、银杏叶提取物EGB761对肢体制动大鼠骨骼肌萎缩的防护效应    【摘要】  目的: 探讨银杏叶提取物EGB761对废用性骨骼肌萎缩的防治作用. 方法: 选用雄性SD大鼠24只,随机分为空白组,对照组,试验组,每组8只. 大鼠右后肢用可塑性石膏由足跖管型固定至膝上1 cm处,膝关节固定于屈曲位100°,踝关节固定于跖屈60°,共4 wk. 对照组每日给予蒸馏水3 mL灌胃,试验组每日给予银杏叶提取物EGB761水溶液灌胃(灌胃剂量120 mg/kg，浓度14 g/L). 4 wk后完整解剖右后肢腓肠肌,检测腓肠肌收缩张力、肌

2、湿重、蛋白质含量、Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP酶活性. 结果: 对照组、试验组与空白组相比,腓肠肌收缩张力、肌湿重、蛋白质含量、Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP 酶活性显著下降(均P<0.05). 试验组与对照组相比,试验组的上述指标显著高于对照组 (均P<0.05). 结论: 银杏叶提取物EGb761能够显著提高废用性萎缩骨骼肌的收缩张力、肌湿重、蛋白质含量、Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP酶活性,从而有效的抑制骨骼肌废用性萎缩的发生.【关键词】  制动 骨骼肌 萎缩 银杏叶提取物0引言肢体制动是骨关节病损的一种主要治疗手段，由此带来的骨骼肌

3、废用性萎缩严重地影响了疾病的治疗和功能的康复，在某些情况下其危害性甚至超过了原发病. 废用性骨骼肌萎缩已成为患者肢体功能恢复的严重障碍,如何对其进行有效防治尤为重要. 本研究旨在观察银杏叶提取物EGB761对后肢制动后大鼠腓肠肌收缩张力、肌湿重、蛋白质含量、Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP酶活性的影响，研究其对骨骼肌废用性萎缩的防护效应.1材料和方法1.1材料1.1.1动物及分组雄性SD大鼠24只，体质量200260 g，由南方医科大学试验动物中心提供，随机分为空白组，对照组，试验组,每组8只.1.1.2主要试剂及仪器银杏叶提取物EGB761购自浙江康恩贝制药股份有限公司，考马斯亮兰蛋

4、白检测试剂盒、ATP酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，PCLab生物信号采集处理系统（VER2.2.0）操作程序由北京微信斯达科技发展有限责任公司提供.1.2方法1.2.1动物模型制备空白组进行笼内自由活动,对照组及试验组大鼠按文献1方法，将大鼠右后肢用可塑性石膏由足跖管型固定至膝上1 cm处，膝关节固定于屈曲位100°，踝关节固定于跖屈60°，以便小腿的肌肉保持于松弛位，共4 wk. 每日检查固定情况，随时进行调整. 石膏浸液掺入苦味酸，以防大鼠啃咬. 对照组每天给予蒸馏水3 mL灌胃，试验组每天给予银杏叶提取物EGB761水溶液(14 g/L)灌胃(120 mg/

5、kg)2.1.2.2取材4 wk后，20 g/L戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉大鼠，完整解剖右后肢腓肠肌，坐骨神经，进行腓肠肌收缩张力检测. 然后切取腓肠肌，去除腱膜、肌腱和神经,进行湿重、蛋白含量及酶活性检测.1.2.3腓肠肌收缩力的测定预先运行PCLab生物信号采集处理系统，将动物牢固固定于实验台上. 取右后肢下段背侧切口，切开皮肤分离出腓肠肌，于近端分离解剖出坐骨神经，远端从肌腱止点处剪断. 用丝线将其与机械?电换能器连接，使肌肉处于最适初长度. 经预实验得知当张力为50 g时，肌肉处于最适初长度. 铂金丝电极置于坐骨神经表面. 经预实验设置单收缩刺激强度为3 V，波宽1 ms,强直刺激幅度3

6、 V,波宽1 ms,串长2 s,首频率50 Hz. 频率增量50 Hz. 电脑可直接记录收缩曲线和测量结果.1.2.4肌湿重的测量将腓肠肌由起点至止点完整的切下，除去肌肉上附着的组织后，在电子天平上称其质量.1.2.5蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法测定肌肉总蛋白含量: 用牛血清蛋白制备标准曲线. 取各组腓肠肌组织，按肌肉水= 19(V/V) 的比例加入生理盐水,用匀浆仪制成20 g/L肌肉匀浆. 按试剂盒要求步骤加入考马斯亮蓝染液,静置后在分光光度计上于波长595 nm处比色. 对照标准曲线求得蛋白含量.1.2.6Na+?K+?ATP 酶及Ca2+?ATP酶活性的测定Na+?K+?ATP 酶及

7、Ca2+?ATP 酶活性的检测程序按照ATP酶测试盒说明书提供的方法进行. 先将每份肌肉标本分别称重,按肌肉水= 19(V/V)的比例在每份标本中加入生理盐水,将肌肉剪碎,在玻璃匀浆管中制成100 g/L的匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清0.2 mL加入0.8 mL生理盐水稀释成20 g/L的匀浆. 匀浆中加入酶促反应的相应试剂，混匀后，4000 r/min离心10 min，取上清200 L定磷. 加入定磷试剂后混匀，37水浴30 min，冷却至室温，在分光光度计660 nm处（1 cm光径，蒸馏水调零）比色，读数. 与标准无机磷酸成色进行比较,酶活性以无机磷(pi) mol

8、/(mg·h)表示.统计学处理:用SPSS 10.0软件采用One?Way ANOVA法，各组间两两比较用LSD法.    2结果2.1腓肠肌收缩张力对照组、试验组与空白组相比，腓肠肌单次收缩最大张力、强直收缩最大张力显著性下降(均P<0.05). 试验组的单次收缩最大张力、强直收缩最大张力显著优于对照组 (均P<0.05,表1).表1各组腓肠肌最大收缩力（略）aP<0.05 vs 空白; cP<0.05 vs 对照.2.2腓肠肌湿重及蛋白质含量对照组、试验组与空白组相比，腓肠肌湿重、蛋白质含量显著性下降(均P<0

9、.05). 试验组的肌湿重、蛋白质含量显著优于对照组(均P<0.05,表2).表2各组腓肠肌湿重及蛋白质含量（略）aP<0.05 vs 空白; cP<0.05 vs 对照.2.3腓肠肌Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP酶活性对照组、试验组与空白组相比，腓肠肌Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP酶活性显著下降(均P<0.05). 试验组的Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP酶活性显著高于对照组(均P<0.05,表3).表3各组腓肠肌Na+?K+?ATP酶及Ca2+?ATP酶活性（略）aP<0.05 vs 空白; cP<0.05 vs 对照.

10、3讨论银杏叶提取物为来源于中药银杏叶的复合药物成份,EGB761是标准银杏叶提取物的代号(主要有效成分是黄酮类和萜类化合物，分别占24%和6 %)，具有多种生理活性：总黄酮苷可以直接消除体内自由基;总内酯可以通过改善骨骼肌微循环加快废物代谢和自由基的清除3-4.  EGB761能提高细胞氧化磷酸化水平，保护Na+?K+?ATP酶活性5. 实验证明EGB761能够有效的延缓去神经支配的骨骼肌萎缩6. 然而,临床上废用性骨骼肌萎缩的发生远远高于去神经支配骨骼肌萎缩的发生,因此探索银杏叶提取物对废用性骨骼肌萎缩的防护效应意义重大.骨骼肌废用时,蛋白分解加强、合成减少，骨骼肌总蛋白含量降低，

11、进而引起肌质量的下降，肌纤维萎缩，造成骨骼肌的形态改变，进一步影响骨骼肌的功能. 总蛋白含量降低使得收缩蛋白含量降低，进而导致收缩装置数量减少7；此外，肌纤维萎缩使得单位面积内肌纤维所占面积减少、细胞间质所占面积增加,也减少了收缩装置的数量. 从而引起整条肌肉的单次收缩与强直收缩的最大张力均发生降低. EGB761能够抑制蛋白酶活性，使肌蛋白的分解减弱、合成加强，稳定了肌蛋白的含量，提高了骨骼肌质量，抑制了肌纤维的萎缩；同时也保持了肌纤维收缩蛋白的含量，稳定了收缩装置的数量，进而提高骨骼肌收缩功能. 肌肉运动的直接能源物质是ATP，而ATP的水解速率又决定于ATP酶活性的高低，因而，ATP酶活

12、性是影响肌肉收缩张力和收缩功率的重要因素. 骨骼肌废用性萎缩时产生大量的自由基，Ca2+?ATP酶和Na+?K+?ATP酶上均含有巯基，自由基可氧化膜上巯基蛋白和含巯基酶，使酶活性降低或丧失.本实验结果表明，大鼠肢体固定后腓肠肌的收缩功能、湿重、蛋白质含量、ATP酶活性显著下降，但是给予银杏叶提取物EGB761处理的大鼠，上述指标下降程度显著低于未经处理的大鼠，说明银杏叶提取物EGB761能够显著的抑制腓肠肌废用性萎缩. 其机制可能有以下几个方面：直接清除自由基，提高S0D活性，减少MDA的产生；清除过多的自由基，削弱自由基对膜蛋白的攻击，维持Ca2+?ATP 酶和Na+?K+?ATP酶的活性

13、5；激活外向型K+通道，使细胞外K+浓度升高，促进Na+?K+?ATP酶的去磷酸化，从而保持其转运活性8. ATP 酶活性的提高可以增强内质网Ca2+的摄入及释放能力，稳定细胞内钙浓度，从而稳定肌细胞的超微结构及代谢水平，提高细胞的生命力和肌纤维的收缩功能.【参考文献】  1 Jozsa L, Kannus P, Thring J, et al. The effect of tenotomy and immobilisation on intramuscular connective tissue.Amorphometric and microscopic study in rat

14、calf musclesJ. J Bone Joint Surg, 1990,72?B:293-297.2 施新猷. 现代实验动物学M. 北京:人民军医出版社,2000:333.3 Varga E, Bodi A, Ferdinandy P, et al. The protective effect of EGb761 in isolated isochemical/reperfused rat heartsJ. Acta Pharm Hung,2002,72(4):265-271.4 Eckert A, Keil U, Kressmann S, et al. Effects of EGb76

15、1 Ginkgo biloba extract on mitochondrial function and oxidative stressJ. Pharmacopsychiatry,2003,36(Suppl 1):15-23.5 Pierre S, Jamme I, Droy?Lefaix MT, et al. Ginkgo biloba extract (EGb761) protects Na, K?ATPase activity during cerebral ischemia in miceJ. Neuroreport, 1999,1:47-51.6 吴朝晖,田涛,金惠铭,等. 银杏叶提取物,肌酸和氨哮素延缓去神经骨骼肌萎缩的实验研究J. 中华创伤杂志,2000,16（11）:681-684.7 Fitts RH, Desplanches D, Romatowski JG, et al. Spaceflight effects on single skeletal muscle fiber fu