谈干细胞水通道蛋白AQP5在小鼠骨髓间充质干细胞分化中的功能大学生论文

1、谈干细胞水通道蛋白AQP5在小鼠骨髓间充质干细胞分化中的功能大学生论文    摘要：水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一类广泛表达在原核和真核细胞膜上快速转运水分子的特异性孔道。哺乳动物水通道蛋白家族包括13个成员（AQP0-AQP12），它们在机体内选择性地表达于多种组织和器官，并行使重要的生理功能。除了完成各种上皮和内皮组织的液体转运外，在其它生命历程中也行使重要的功能，包括细胞迁移、增殖、凋亡、细胞体积调控、神经信号转导、线粒体新陈代谢、免疫细胞功能等，以而影响机体血管生成、肿瘤细胞的生长与侵入、组织损伤修复、维持细胞稳态和免疫系统功能

2、等多种重要的生命活动。近些年来，人们对水通道蛋白结构与功能的探讨已经广泛的开展，所利用的探讨策略与手段也比较丰富，关于水通道蛋白生理功能的探讨不断有新的重要发现。但是，水通道蛋白在干细胞功能中的作用探讨很少。有报道称水通道蛋白在神经干细胞上表达，并影响其增殖、迁移和神经分化，这些结果提示我们水通道蛋白可能在间充质干细胞的生理功能中发挥重要的作用。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一群异质类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛分布于多种组织和器官。由于MSCs来源丰富、体外增殖能力强、多项分化潜能、免疫原性低等优点，在以细胞为基础的组织损伤修复诊

3、疗中一直是探讨的热点。本探讨中首先通过RT-PCR、Western Blot和免疫荧光等分子生物学手段发现水通道蛋白AQP5在骨髓起源的间充质干细胞（bone marrow-derivedMSCs，BMSCs）质膜高表达，而后发现AQP5敲除小鼠BMSCs的质膜水通透性显著低于野生鼠。并通过免疫荧光、克隆形成实验和细胞计数实验发现两种基因型BMSCs在细胞形态和增殖能力方面没有显著差别。但是在多项分化潜能方面，通过定向诱导后用油红O染色（成脂肪），茜素红S和碱性磷酸酶染色（成骨），Collagen II和番红素O染色（成软骨）发现AQP5敲除显著提升了BMSCs的成脂、成骨和成软骨分化潜能。运

4、用尼罗红定量、钙离子、碱性磷酸酶和胞外糖胺多糖含量的测定和通过检测三系诱导分化特异标记分子（PPAR2, C/EBP, adipsin, collagen1a, osteopontin,ALP, collagen11a,collagen2a和aggrecan）的相对mRNA表达水平进一步证实了上面陈述的结果。在钻孔骨损伤修复实验中发现，损伤后14和21天，AQP5基因敲除小鼠骨损伤修复速度显著快于野生鼠。在对这一表型的机理探讨中，我们发现AQP5敲除显著降低了分化中BMSCs的凋亡率。运用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK结果显示Z-VAD-FMK显著提升了AQP5敲除小鼠和野生鼠BMSCs的分化能

5、力，但野生鼠提升的幅度更大。这一结果表明AQP5介导的高质膜水通透性提升了分化中BMSCs的凋亡率，因而降低了其分化能力。本探讨首次发现AQP5在BMSCs质膜上表达并且在BMSCs分化能力方面可能具有重要作用，提示水通道蛋白AQP5可能成为调控组织再生和损伤修复的新分子靶标。    关键词：AQP5论文 骨髓起源间充质干细胞论文 分化论文 骨损伤修复论文 凋亡论文         摘要4-5Abstract5-7目录7-10第一部分 引言10-27一、 水通道蛋白的发现、命

6、名与分类10二、 水通道蛋白的结构10-12三、 水通道蛋白的表达和生理功能12-13四、 水通道蛋白 5（AQP5）的结构、表达及功能13-16（一）AQP5 的结构13-14（二）AQP5 的表达及功能14-16五、 间充质干细胞的发现、组织来源、生物学特性及生理功能16-18（一）间充质干细胞的发现及组织来源16（二）间充质干细胞的生物学特性及生理功能16-18六、 间充质干细胞的自我更新和干性的维持18-20（一）间充质干细胞的自我更新18-19（二）间充质干细胞的干性（stemness）维持19-20七、 间充质干细胞的分化潜能与信号分子调控20-24（一）间充质干细胞的分化潜能20

7、-21（二）间充质干细胞多分化潜能的分子调控21-。    公开发表论文及著作情况77上一页1224八、 间充质干细胞归巢机制24-25九、 本探讨的目的和作用25-27第二部分 材料与策略27-42一、 实验材料27-29（一）主要生化和分子生物学试剂27-28（二）主要实验仪器和数据浅析软件28（三）实验动物28-29二、 实验策略29-41（一）小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养29（二）RT-PCR 检测29-31（三）免疫印迹31-33（四）免疫荧光33-34（五）流式细胞术测定 BMSCs 纯度34（六）水通透性测定34（七）BMSCs 增殖能

8、力测定34-35（八）BMSCs 的多项分化特性35-37（九）HE 染色和免疫组化37-38（十）实时定量 PCR（Real-time quantitative PCR）38-40（十一）骨损伤修复实验40（十二）细胞凋亡检测40-41三、 统计学浅析41-42第三部分 实验结果42-59一、 水通道 AQP5 在小鼠骨髓间充质干细胞的表达42-44（一）AQP5 在小鼠骨髓贴壁细胞的表达42-43（二）AQP5 在小鼠骨髓间充质干细胞的表达43-44二、 水通道 AQP5 敲除使 BMSCs 水通透能力下降44-47（一）小鼠 BMSCs 的原代分离与培养44-45（二）小鼠 BMSCs

9、纯度鉴定45-46（三）AQP5-/-BMSCs 水转运功能降低46-47三、 水通道 AQP5 敲除没有影响 BMSCs 增殖能力47-48（一）克隆形成实验（CFU-F）47（二）细胞数检测47-48四、 水通道 AQP5 敲除增强了 BMSCs 分化潜能48-52（一）AQP5-/-BMSCs 成脂肪分化能力增强48-49（二）AQP5-/-BMSCs 成骨分化能力增强49-51（三）AQP5-/-BMSCs 成软骨分化能力增强51-52五、 水通道 AQP5 敲除加速了骨损伤修复52-54（一）骨密度的测定52-53（二）骨损伤修复形态学浅析53-54六、 AQP5 敲除使分化能力增强的机制探讨54-59（一）分化历程中细胞数浅析54-55（二）AQP5 敲除使 BMSCs 凋亡率降低55-56（三）运用凋亡抑制剂检测分化能力56-57（四）AQP5 可能影响 BMSCs 分化的信号通路57-59第四部分 讨论5