黄曲霉毒素M1检测试剂

1、黄曲霉毒素M1检测试剂Aflatoxin M1RIDASCREEN® Aflatoxin M1简介RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15产品编号: (R1111)采用竞争酶标免疫法定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔（包括标准试验）如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）样品制备牛奶：脱脂奶粉：还原、脱脂奶酪：提取、离心时间要求：（以10个样品为例）牛奶/奶粉.奶酪.大约2小时孵育时间时间.大约1小时检测下限牛奶/奶粉：5ppt奶酪：50ppt

2、回收率牛奶：大约95奶粉：大约95奶酪：大约102交叉反应黄曲霉毒素M1.100黄曲霉毒素M2.301. 产品用途RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15试剂盒利用竞争性酶免疫分析方法，用于定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。2. 概述黄曲霉毒素是Aspergillus flavus 和 Aspergillus parasiticus等霉菌的代谢产物，能致癌，高毒。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的代谢产物。经摄入含有黄曲霉毒素B1饲料的奶牛产出的牛奶中，其中便含有黄曲霉毒素M1。由于黄曲霉毒素M1相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素M1不

3、仅要在饲料原料中检测，而且在最终产品中也需要进行鉴定。自1999年一月开始，欧盟就制定了黄曲霉毒素残留的检测限，黄曲霉毒素M1的检测限为0.05 g/l (50 ppt)。使用RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15可以精确定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。3. 测定原理测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对黄曲霉毒素M1的特异性抗体。加入标准或样品溶液和在洗板后加入黄曲霉毒素酶标记物，游离黄曲霉毒素M1与黄曲霉毒素M1酶标记物竞争结合黄曲霉毒素M1抗体的结合位点（竞争性酶免疫分析方法）。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。加入底物/发色剂到孔中并

4、且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色产生由蓝色变成黄色。在450nm处测量，吸光值与样品中黄曲霉毒素M1浓度成反比。4 提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔）盒中的材料如下：1×96孔板（12条 X 8孔）包被有黄曲霉毒素M1抗体6×黄曲霉毒素M1标准液，1.3 ml/瓶浓度为：0 ppt， 5 ppt，10 ppt，20 ppt，40 ppt，80 ppt黄曲霉毒素M1的牛奶缓冲液1×ml）.红色帽过氧化物酶标记物的黄曲霉毒素M11×底物/发色剂（12ml）. 棕色色帽微红色，包含四甲基苯

5、醌1×反应停止液（14ml）. 黄色帽为1N硫酸1×缓冲液1（20ml）样品稀释缓冲液1×缓冲液2（12ml）. .白色帽酶标记物稀释缓冲液1×洗涤缓冲液为10Mm的磷酸缓冲液（pH7.4），包含0.05%的Tween205. 需要的材料但盒中不提供-微孔板酶标仪(450nm)-离心机-巴氏吸液管-刻度吸量管-50ul，100ul，400ul微量加样器-只用于奶酪检测-振荡器-蒸发器5.2 试剂-甲醇-n-庚烷-二氯甲烷-PBS-缓冲液，：0.55g NaH2PO4 x H2O+ 2.85g Na2HPO4 x 2H2O +9gNaCl , 加入蒸馏水至

6、1000ml6. 操作者应该注意之事项-标准液含有黄曲霉毒素M1（致癌），要特别小心，应戴手套，避免试剂接触皮肤-使用过的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜-反应停止液为1N硫酸，避免接触皮肤-不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低-不要交换使用不同批号的盒中试剂7. 储存条件-保存试剂盒于2-80C。不要冷冻-将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封-标准物质对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下-无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下8 试剂变质的迹象发色试剂若显色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6个

7、单位 (A450nm<0.6)时，表示试剂可能变质。9 样品处理9.1. 牛奶-取牛奶样品，用冷冻离心机（3500g ，10）离心10分钟去除脂肪（如没有冷冻离心机，可将样品先冷却到10，再离心）-离心后用巴氏吸液管彻底去除上层奶油。-取脱脂牛奶用于检测（每孔100l）9.2. 奶粉-用天平称取10g奶粉到容量瓶加去离子水到100ml。（还原牛奶）-震荡5分钟，使充分溶解。-按照牛奶样品处理步骤进行9.3. 奶酪代表性的样品应该研磨，充分混合。整个均质过程不要加入任何液体。如果奶酪表面呈现出不同状态，则不要取奶酪表面作为样品，否则将影响检测结果。-称取2 g研磨过的奶酪，装入玻璃离心管中

8、。-加入40ml二氯甲烷，放在振荡器上震荡15分钟。-过滤后取10ml滤液60 °C氮气吹干-将吹干残留的油状物用0.5 ml甲醇、0.5 ml PBS缓冲液（参见5.2.）和1 ml庚烷充分混合溶解。-离心: 15分钟 / 2700 g / 15 °C -完全除去上层庚烷层。-用巴氏移液管小心移取部分甲醇水层-取100 l甲醇水层用400 l缓冲液1稀释成为含10%甲醇的溶液-每孔用100 l进行检测。 备注:如果需要进一步稀释溶液，则使用缓冲液1进行稀释。10. 酶标免疫分析程序1. 用之前将所有试剂回升至室温（20-25）。2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8。 3

9、. 在使用中不要让微孔干燥。4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。5. 在所有孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。10.2 黄曲霉毒素M1酶标记物Aflatoxin M1 酶标记物（红帽）为浓缩液。由于稀释了的酶标记物稳定性不好，因此只稀释需用量的酶标记物。稀释前酶标记物应轻轻振荡混匀。酶标记物用缓冲液2（白帽）以1: 11的比例稀释(400 l浓缩液+ 4.0 ml 缓冲液，足够4个微孔板条32孔检测)10.3 洗涤缓冲液在试剂盒中提供一包洗涤缓冲液的粉剂，一包粉剂溶解于1升的蒸馏水中，制备好的洗涤缓冲液在4o

10、C条件下可以保存4周。10.4 包被有抗体的微孔板条锡箔袋沿横向边压封线外侧剪开。取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-80C。不要冷冻。10.5 测定程序 （在20-25 oC条件下操作）1将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。2. 加入100ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，轻轻震板混合，在室温（20-25 oC）暗处孵育30分钟。3倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液（见10.3）再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，

11、重复操作洗涤步骤两次以上。4加入100ul酶标记物（红色帽）到微孔底部，轻轻震板混合，在室温（20-25 oC）暗处孵育15分钟。5倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液（见10.3）再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，重复操作洗涤步骤两次以上。6加入100ul底物/发色剂到微孔中，混合后在室温（20-25 oC）暗处孵育15分钟。7加入100ul反应停止液到微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，15分钟内读取光度值。11. 结果所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因

12、此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。标准的吸光度值（或样品） × 100= %吸光度值0标准的吸光度值计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素M1浓度（ng/l）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在10-40 ng/l （ppt）范围内应当成为线性，相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。为了得到样品中黄曲霉毒素M1的含量（ng/l），在标准曲线上读取的浓度必须乘以相应的稀释倍数。样品的稀释倍数如下：牛奶.1奶粉/奶酪. 10R-Biopharm开发出用于计算ELISA试剂盒检测结果的专用软件RIDA® SOFT，可以向当地分销商索取该软件。12 灵敏度RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15试剂盒的最低检测下限为大约5 ppt，按照样品处理记录，牛奶、奶粉的检测限为5 ppt，奶酪的检测限为5 0ppt。13 特异性RIDASCREEN®黄曲霉毒素M1 30/15试剂盒的特异性通过对相应的霉菌毒素交叉反应性分析而得到：交叉反应：黄曲霉毒素M1. 100 %黄曲霉毒素M2. 30 %14 再